高盐摄入是导致慢性非传染性疾病，尤其是心血管疾病的主要饮食风险因素，并且全球一半以上的死亡与饮食相关。即便世界卫生组织（WHO）推荐膳食盐摄入量为<5g/天，并且过去20年还采取了各种减盐策略，但全世界大多数人群的每日摄入量仍然>10g。高盐摄入可导致离子稳态失衡、交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活、胰岛素抵抗等病理生理变化，进而引发心、脑、肾等多器官损害血管。
作为营养物质进入血液的第一道屏障，肝脏通过门静脉从肠道接收大部分血液供应，门静脉富含细菌产物、环境毒素和食物抗原。受伤的肝细胞会释放许多促炎细胞因子和趋化因子，从而激活肝脏中的常驻和浸润免疫细胞。临床证据表明，高盐摄入与非酒精性脂肪肝（NAFLD）以及晚期肝纤维化的风险增加独立相关，但作为心血管疾病的潜在独立危险因素，NAFLD个体发生10年心血管事件的风险更高。并且，NAFLD还可通过引发全身炎症、诱导胰岛素抵抗、增加氧化应激等来促进高血压。
有证据指出，由多种饮食和代谢因素引起的靶器官损伤，表现出一种“代谢记忆”现象。作为活性氧的主要来源，线粒体功能障碍不仅会降低氧化呼吸链的活性，导致肝脏脂肪沉积，还会触发先天免疫反应，从而促进NAFLD的发生。
近日，由陆军军医大学大坪医院高血压和代谢疾病中心祝之明团队在心血管领域顶级期刊Circulation上发表了题为“Salt-Induced Hepatic Inflammatory Memory Contributes to Cardiovascular Damage Through Epigenetic Modulation of SIRT3”的研究论文。在本研究中，团队证明长期高盐饮食可导致高血压和心脏功能障碍，引发肝脏脂肪变性和炎症，并且这种损伤在停盐后持续存在，表现出“记忆”现象；机制上，肝脏中SIRT3的持续低表达是盐诱导肝脏炎症和脂肪变性的重要介质，可通过过表达SIRT3或二甲双胍治疗来缓解，抵消盐诱导的心血管损伤；乙酰化H3K27（H3K27ac）的增加抑制了NRF2对SIRT3启动子的结合活性，导致停盐后SIRT3持续低表达（图1）。
图1 高盐诱导肝脏代谢记忆的分子机制和二甲双胍的治疗作用示意图。
首先研究人员们发现，高盐饮食（HSD）在不影响心率的情况下，可导致收缩压显著升高，但心脏功能明显受损，射血分数和短轴缩短率降低（图2C、D）。此外，HSD也显著增加了血清中促炎标志物水平以及天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）浓度与比率（图2E、F）。并且，HSD小鼠表现出更高的肝脏重量/体重比（图2G）。值得注意的是，恢复正常饮食后，以上现象均未得到明显改善，表明HSD诱导存在持续肝损伤和血管损伤。
进一步的研究发现，HSD还刺激肝脏中的脂质积累、脂肪变性和纤维化与脂质含量水平，包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和非酯化脂肪酸（NEFA），以及中性粒细胞和巨噬细胞的浸润（图2H-L）；同样的，恢复正常饮食后，以上病理变化均未得到明显改善。这些结果表明，高盐引起的肝损伤表现出“记忆”特征。
图2 高盐引起的肝损伤表现出“记忆”特征。（A）小鼠干预喂养方案示意图。（B）正常盐饮食（NSD）、高盐饮食（HSD）或HSD-NSD小鼠体重或食物摄入变化。（C）指定心血管参数。（D）24h动态收缩压（SBP）或舒张压（DBP）。（E）促炎标志物血清浓度。（F）ALT与AST的血清浓度以及AST与ALT比率。（G）肝脏重量与体重比率。（H）肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（中）和天狼星红染色（下）代表性图像。（I）肝脏切片的NAFLD活动度积分（NAS）（左）、脂滴区域（中）和纤维化区域（右）。（J）肝脏的脂质含量。（K）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞标志物的免疫荧光染色代表性图像。
介于线粒体功能障碍是导致肝脏炎症的重要因素，而SIRT3又是一种关键的线粒体脱乙酰酶，因此，团队接下来检测了小鼠肝脏组织中的SIRT3表达水平。结果发现，肝脏中SIRT3的表达被HSD显著抑制，即使在停盐后依然如此（图3A）；其因短期HSD升高，但在长期HSD干预后降低（图3B）。除较低的肝脏重量与体重比（图3C）外，过表达SIRT3后，小鼠AST（图3D）、促炎因子（图3E）水平均显著降低，且缓解了停盐后肝细胞脂肪变性、脂质积累、纤维化以及炎症细胞浸润，并抑制了促炎基因表达（图3F-J），降低了盐诱导的高血压，还拮抗了断盐后的心功能不全（图3K-L），说明肝脏中SIRT3低表达是高盐诱导心血管损伤的关键一环。
图3 肝脏中的“记忆”现象与SIRT3持续低表达有关。（A）qPCR分析肝脏中指定基因mRNA水平。（B）Western Blot检测小鼠肝脏中SIRT3水平。（C）肝脏重量与体重比。（D）ALT与AST的血清浓度以及AST与ALT比率。（E）促炎标志物血清浓度。（F）肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（中）和天狼星红染色（下）代表性图像。（G）肝脏切片的NAS（上左）、脂滴区域（上中）、纤维化区域（上右）以及肝脏的脂质含量（下）。（H）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞标志物的免疫荧光染色代表性图像。（I）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞的阳性数。（J）Western Blot检测小鼠肝脏中的相关蛋白表达。（K）24h SBP或DBP。（L）小鼠指定心血管参数。
接下来，团队使用SIRT3敲除（SIRT3-/-）小鼠来模拟SIRT3表达下降状态，结果发现，敲除SIRT3未能影响基线时的肝脏重量与体重比率，但进一步加剧了HSD条件下该指数的增加（图4A）。在SIRT3-/-小鼠中，HSD诱导的肝损伤、组织学变化和炎性细胞浸润也更加严重，但不影响血浆脂质含量和葡萄糖水平（图4B–D）。而且，敲除SIRT3直接增加了促炎基因表达，进一步加剧了HSD对这些细胞因子的促进作用（图4E）以及诱发高血压和心功能不全（图4F）。
为了进一步确定SIRT3在肝脏中的作用，使用Cre-loxP系统建立了肝脏特异性SIRT3敲除小鼠，并喂食HSD（图4G）。正如预期的那样，这导致了更严重的肝脏脂肪变性和纤维化，且伴有更严重的高血压和心功能不全（图4H-J）。
图4 肝脏中SIRT3的持续减少引发盐诱导炎症“记忆”。（A）喂食NSD或HSD的SIRT3+/+或SIRT3–/–小鼠体重（顶部）、肝脏重量与体重比率（底部）。（B、H）指定小鼠肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（中）和天狼星红染色（下）代表性图像。（C）肝脏切片的NAS（上左）、脂滴区域（上中）、纤维化区域（上右）以及肝脏的脂质含量（下）。（D）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞标志物的免疫荧光染色代表性图像。（E）Western Blot检测小鼠肝脏中的相关蛋白表达。（F、I）24h SBP或DBP。（G）SIRT3fl/fl或Alb-SIRT3fl/fl小鼠指定组织中SIRT3 mRNA表达水平。（J）小鼠指定心血管参数。
H3K27ac 对NRF2结合的抑制是停盐后SIRT3表达持续下降的主要原因
由于DNA甲基化在抑制基因表达中起重要作用，团队研究了与Sirt3基因相关的DNA甲基化状态，以解释盐负荷的持续低表达。ChIP结果显示，H3K27ac与SIRT3启动子的结合显著增加，同时该位点的三甲基化减少，并且这些组蛋白修饰的变化在去盐后仍然存在（图5A），但高盐诱导的组蛋白修饰变化不仅仅局限于SIRT3基因（图5B、C）。敲除或抑制p300可缓解H3K27过度乙酰化并降低去盐后的促炎基因表达水平，同时，Sirt3的降低表达也恢复到正常水平（图5D、E）。HSD显著抑制NRF2与肝组织中Sirt3启动子区域结合，并在转换为NSD后持续存在（图5F）。重要的是，增强H3K27ac水平会降低NRF2结合能力，但随时间推移，NRF2结合减少，H3K27ac逐渐增加，并伴随着SIRT3表达减少（图5H-J），并且，SIRT3表达亦先升后降，与NRF2结合水平一致（图5K）。
图5 H3K27ac对NRF2结合的抑制是停盐后SIRT3表达持续下降的主要原因。（A-C）ChIP- qPCR结果。（D、F-H、J）不同条件下，H3K27ac、H3K27me3、NRF2分别与Sirt3启动子的相对结合水平。（E、I、K）不同条件下，相关基因的qPCR分析。
NRF2 介导的表观遗传修饰对SIRT3 表达抑制至关重要
进一步地，团队通过qPCR检测相关基因mRNA水平发现，NRF2结合SIRT3启动子的限制对于抑制高盐诱导组蛋白表观遗传修饰调控SIRT3表达至关重要（图6A），并且确定了NRF2的肝脏特异性（图6B）。随后，肝脏SIRT3表达挽救实验结果表明，其可显著抑制NRF2敲除对HSD诱导肝损伤的促进作用（图6C-E）。
此外，在HSD喂养NRF2-/-小鼠的肝脏中，编码促炎因子的基因表达升高也因SIRT3过表达而得到改善（图6F、G），但NRF2的过表达未能缓解HSD诱导的肝脏脂肪变性和脂质积累（图6H-J），且炎症基因表达无差异（图6K）。这些结果表明，作为NRF2下游靶点，抑制SIRT3表达是NRF2敲除对肝脏炎症促进作用的主要原因，而NRF2的保肝作用需要SIRT3。
图6 NRF2介导的表观遗传修饰对SIRT3表达抑制至关重要。（A、B）qPCR分析相关基因mRNA水平。（C、H）肝脏重量与体重比率。（D、I）肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（下）代表性图像。（E、J）肝脏切片的NAS（上左）、脂滴区域（上右）以及肝脏的脂质含量（下）。（F）Western Blot检测小鼠肝脏中相关蛋白表达。（G、K）qPCR检测小鼠肝脏中相关mRNA水平。（H）
二甲双胍阻断盐诱导的肝脏炎症记忆和心血管损伤的治疗
接下来，团队试图研究哪种干预措施可以防治盐诱导炎症记忆。介于二甲双胍是众所周知的AMPK激活剂，可改善由高糖或HFD引起的持续性靶器官损伤，团队采用二甲双胍对小鼠进行治疗，结果表明，其可显著降低肝脏重量与体重比率、血清AST/ALT比值及促炎标志物（图7B-D），完全抑制盐记忆现象（图7E-H），改善由HSD引起的持续性高血压和心功能不全（图7I、J）。
基因表达分析显示，二甲双胍显著降低了HSD小鼠的炎症和纤维化相关基因表达，并在除盐后抑制了这些基因的高表达，伴随SIRT3高表达和AMPK激活（图7K、L）。这些结果表明二甲双胍对盐诱导肝脏炎症记忆具有有效的抑制作用。
图7 二甲双胍阻断盐诱导的肝脏炎症记忆和心血管损伤的治疗。（A）小鼠干预喂养方案示意图。（B）肝脏重量与体重比率。（C）ALT与AST的血清浓度以及AST与ALT比率。（D）促炎标志物血清浓度。（E）肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（中）和天狼星红染色（下）代表性图像。（F）肝脏切片的NAS（上左）、脂滴区域（上中）、纤维化区域（上右）以及肝脏的脂质含量（下）。（G）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞标志物的免疫荧光染色代表性图像。（H）肝脏中性粒细胞和巨噬细胞的阳性数。（I）24h SBP或DBP。（J）指定心血管参数。（K、L）Western Blot检测相关蛋白（K）及定量结果（L）。
二甲双胍对盐诱导炎症“记忆”预防作用由AMPK介导
最后，团队发现敲除AMPKα2后，不仅阻断了二甲双胍对HSD诱导肝脂肪变性的预防作用，还抑制了二甲双胍在停盐后对这些特征的治疗改善作用（图7A-C）。值得注意的是，AMPKα2-/-小鼠在改用含有二甲双胍的饮食后，促炎基因表达水平显著升高，其对SIRT3表达的促进作用伴随AMPK失活而消失（图7D-F）。由此可见，AMPK是二甲双胍预防和治疗高盐诱导肝脏炎症和肝脂肪变性所必需的，且SIRT3激活依赖于AMPK。
图8 二甲双胍对盐诱导炎症“记忆”预防作用由AMPK介导。（A）肝脏重量与体重比率。（B）肝脏切片的HE染色（上）、油红O染色（下）代表性图像。（C）肝脏切片的NAS（上左）、脂滴区域（上右）以及肝脏的脂质含量（下）。（D、E）Western Blot检测相关蛋白（D）及定量结果（E）。（F）qPCR分析肝脏中炎症相关基因mRNA水平。
doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.055600.
Salt-Induced Hepatic Inflammatory Memory Contributes to Cardiovascular Damage Through Epigenetic Modulation of SIRT3
背景：High salt intake is the leading dietary risk factor for cardiovascular diseases. Although clinical evidence suggests that high salt intake is associated with nonalcoholic fatty liver disease, which is an independent risk factor for cardiovascular diseases, it remains elusive whether salt-induced hepatic damage leads to the development of cardiovascular diseases.
方法：Mice were fed with normal or high-salt diet for 8 weeks to determine the effect of salt loading on liver histological changes and blood pressure, and salt withdrawal and metformin treatment were also conducted on some high-salt diet-fed mice. Adeno-associated virus 8, global knockout, or tissue-specific knockout mice were used to manipulate the expression of some target genes in vivo, including SIRT3 (sirtuin 3), NRF2 (NF-E2-related factor 2), and AMPK (AMP-activated protein kinase).
结果：Mice fed with a high-salt diet displayed obvious hepatic steatosis and inflammation, accompanied with hypertension and cardiac dysfunction. All these pathological changes persisted after salt withdrawal, displaying a memory phenomenon. Gene expression analysis and phenotypes of SIRT3 knockout mice revealed that reduced expression of SIRT3 was a chief culprit responsible for the persistent inflammation in the liver, and recovering SIRT3 expression in the liver effectively inhibits the sustained hepatic inflammation and cardiovascular damage. Mechanistical studies reveal that high salt increases acetylated histone 3 lysine 27 (H3K27ac) on SIRT3 promoter in hepatocytes, thus inhibiting the binding of NRF2, and results in the sustained inhibition of SIRT3 expression. Treatment with metformin activated AMPK, which inhibited salt-induced hepatic inflammatory memory and cardiovascular damage by lowering the H3K27ac level on SIRT3 promoter, and increased NRF2 binding ability to activate SIRT3 expression.
结论：This study demonstrates that SIRT3 inhibition caused by histone modification is the key factor for the persistent hepatic steatosis and inflammation that contributes to cardiovascular damage under high salt loading. Avoidance of excessive salt intake and active intervention of epigenetic modification may help to stave off the persistent inflammatory status that underlies high-salt-induced cardiovascular damage in clinical practice.
关键词：cardiovascular diseases; epigenomics; histones; metformin; non-alcoholic fatty liver disease; sirtuin 3; sodium chloride, dietary.
