研究背景
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种隐匿起病、进行性发展的神经退行性疾病，其病理特征为β淀粉样蛋白（Aβ）斑块形成和神经原纤维缠结（NFTs）（Knopman DS, et al. 2021）。AD患者通常表现为进行性认知能力下降，如记忆力衰退、语言功能障碍、执行力和注意力差等，严重影响患者社交、职业与日常生活功能。AD不仅给患者带来灾难性影响，也给家庭和社会带来沉重的经济和照料负担。目前临床上AD的诊断方式主要通过检测脑脊液中Aβ、Tau和p-Tau蛋白水平和脑部PET-CT检查。但是，由于脑脊液采集具有侵入性，患者接受度比较差；而PET-CT检查由于价格昂贵，也难以在早期患者和无症状期人群中广泛使用。因此，开发便捷的AD早期诊断方法一直是该领域的瓶颈问题。
2024年1月2日，浙江大学吴志英团队等在Cell子刊The Innovation杂志（IF：33.2）发表题为“Alzheimer’s disease early diagnostic and staging biomarkers revealed by large-scale cerebrospinal fluid and serum proteomic profiling”的文章。通过收集AD病人脑脊液（CSF）以及血清样本进行蛋白质组分析，借助机器学习模型开发了用于AD早期诊断的包含19种脑脊液蛋白和8种血清的蛋白质panel，并验证了21种脑脊液和18种血清的核心的AD阶段依赖性差异蛋白，分析了这些蛋白作为识别AD早期诊断和分期生物标志物的潜力。
整体研究思路
研究结果
1、蛋白质组学揭示AD诱导的轻度认知障碍（MCI）患者中显著差异蛋白
为了确定AD早期脑脊液（CSF）诊断标志物，作者对发现队列中AD样本和对照样本（CN）中脑脊液进行TMT蛋白质组分析。在190种差异蛋白中，185种蛋白表达上调，5种蛋白表达下调，排除与肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病相关的蛋白后，最终确定167种表达上调蛋白和4种表达下调蛋白可作为AD导致的MCI中CSF诊断的标志物（图2A）。作者继续通过Ingenuity途径分析（IPA）对差异蛋白进行富集分析发现，细胞外基质（ECM）代谢在AD发病机制中发挥关键作用（图2B-2C）。通过匹配血清蛋白质组学数据，作者在AD引起的MCI和CN组鉴定出49个失调蛋白，并通过IPA富集分析发现主要集中在视黄酸生物合成、自然杀伤细胞信号以及树突状细胞成熟等信号通路（图2D-2F）。
2、在独立队列中验证发现队列差异蛋白
为验证发现队列中的差异蛋白，作者在一个独立的多中心队列中进行平行反应监测（PRM）靶向蛋白质组学，对发现队列中的57种脑脊液差异蛋白和12种血清差异蛋白进行验证，并利用5×FAD小鼠模型对这些差异蛋白的转录表达水平是否存在差异进行进行PCR验证。此外，为了探索利用差异蛋白区分AD诱导的MCI和CN，作者首先使用21名MCI和52名CN的CSF蛋白质组学数据构建随机森林机器学习模型，确定了包含19种蛋白质的panel，作为AD早期CSF诊断标志物，发现该panel在测试群体中表现出极高的准确性（AUC = 0.984）。通过查阅文献发现，在19种差异蛋白中，4种蛋白（MGAT2、GM2A、MAN1C1和MAN2A2）与高尔基体和溶酶体途径相关；2种蛋白（PCDHG5和IGHM）与免疫功能相关，这些途径与AD的发生具有密切相关性（图3）。
随后，作者还利用23名MCI和45名CN的血清蛋白质组学数据构建随机森林机器学习模型，确定了包括8种蛋白质的panel，该panel在测试群体中虽然准确性略低于CSF（AUC = 0.881），但对于利用血清样本进行AD诊断预测仍具有较高的潜力（图4）。
3、AD诱导的MCI患者CSF和血清差异蛋白与Aβ42、Tau和p-Tau水平相关
作者进一步分析发现，在19个CSF早期诊断生物标志物中，2种蛋白（CHRD和COL18A1）的水平与CSF中Aβ42的水平相关，4种蛋白（B3GALNT1、GM2A、SHBG和IGHM）的水平与CSF中p-Tau的水平相关，2种蛋白（MAN2A2和PCDHGC5）的水平与CSF中Tau的水平相关。在8个血清早期诊断生物标志物中，C4B的水平与CSF中Aβ42的水平相关，IGHV3-35的水平与CSF中p-Tau的水平相关，SERPINA11的水平与CSF中Tau和p-Tau的水平相关。这些相关蛋白只占panel蛋白的一部分，表明AD的进展除了Aβ和p-tau之外，还受到多种分子途径的影响（图5）。
4、AD进展中显著改变蛋白质
为了鉴定AD分期生物标志物，作者比较了CSF中AD不同阶段（AD轻度期ADM、AD中度期ADMO和AD重度期ADS）诱导的MCI中的差异蛋白，并将差异蛋白分为8个cluster，发现cluster 7和cluster 8伴随疾病进程表现出类似的调节趋势。对于18种选定的显著差异蛋白进行信号通路分析发现，通路主要涉及胰岛素、钙依赖性蛋白激酶II、微管相关蛋白Tau（MAPT）等其他公认的AD CSF标志物如GFAP、MAPT、NEFL和神经颗粒蛋白。对血清差异蛋白进行类似分析发现，差异蛋白同样可分为8个cluster，其中cluster 5和cluster 6伴随疾病进程调节趋势类似，并且18种选定的显著差异蛋白表现出明显的阶段依赖性（图6）。
5、验证队列具有AD阶段依赖性的差异蛋白
对于验证队列中的参与者，作者分别收集了CSF和血清样品对AD阶段依赖性差异蛋白进行验证。在CSF样品中，作者验证了21种具有阶段依赖性改变的差异蛋白，发现9种蛋白随疾病进展表达下调，12种蛋白随疾病进展表达上调。其中已被用作AD、PD和ALS神经元损伤的替代标志物蛋白YWHAE和YWHAG蛋白表达同样上调，表明这两个蛋白作为AD分期标志物具有较大潜力。在血清样品中，作者验证了18种具有阶段依赖性改变的差异蛋白，发现5种蛋白随疾病进展表达下调，13种蛋白随疾病进展表达上调。其中与CSF结果类似，YWHAE和YWHAG蛋白同源蛋白YWHAQ在血清中表达显著上调（图7）。
总结
在本研究中，作者分别收集AD患者的CSF和血清样本进行蛋白质组学分析，并且基于机器学习和独立的多中心验证队列，开发了针对CSF样本的包含19个蛋白的CSF panel和针对血清样本的包含8个核心蛋白的血清panel用于AD的早期分型和诊断。此外，作者还鉴定了能够反映不同AD 分期的21个CSF蛋白和18个血清蛋白。这些结果为开发用于临床AD筛查和分期的基于血液的测试提供了基础。
参考文献
[1] Knopman DS, Amieva H, Petersen RC, et al. Alzheimer disease [J]. Nat Rev Dis Primers, 2021, 7(1): 33.
[2] Tao QQ, Cai C, Xue YY, et al. Alzheimer’s disease early diagnostic and staging biomarkers revealed by large-scale cerebrospinal fluid and serum proteomic profiling [J]. Innovation (Camb), 2024, 5(1): 100544.
