蛋白质翻译后修饰（Post-translational modification， PTM）是指蛋白质在核糖体上完成生物合成之后，发生的一系列化学修饰过程。蛋白质在翻译后可通过共价键添加或移除化学基团进行修饰，这些修饰可以发生在蛋白质的氨基酸残基上，也可以发生在蛋白质的主链上，从而改变蛋白质的结构、功能、稳定性、定位以及与其他分子的相互作用。常见的蛋白质翻译后修饰有磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化、甲基化、乳酸化等等。
随着现在抗体开发越来越全面，许多蛋白翻译后修饰的特异性抗体或者泛抗体已经成功被研发出来，对于研究蛋白翻译后修饰有重要帮助。前面几期“带你走近“后基因组”时代的主角—蛋白质组学”、“带你了解关于蛋白质翻译后修饰的简单介绍”、“蛋白翻译后修饰研究会很难？Co-IP技术轻松解决”、“蛋白质翻译后修饰要如何研究呢？”已经介绍了一些关于蛋白翻译后修饰组学及分子生物学检测手段，下面就由小医来为大家总结一下蛋白翻译后修饰的分子生物学验证技术。
一
直接通过特异性抗体检测
这类特异性抗体往往带有特定的修饰位点，可以通过WB或者免疫荧光检测某个蛋白在翻译后修饰的相对含量，这类抗体最常见的是蛋白磷酸化抗体。P65蛋白也被称为RelA，是NF-κB家族中的一个关键转录因子，当P65蛋白发生磷酸化（p-P65）而被激活，进入细胞核调控下游基因的转录表达。因此，检测P65蛋白磷酸化水平十分重要。如图2所示，直接用p-P65蛋白的特异性抗体进行WB检测，同时还需检测总蛋白P65含量，最终以p-P65/P65比值来分析蛋白磷酸化的发生情况。
蛋白乙酰化（Protein Acetylation）是一种常见的翻译后修饰，涉及在蛋白质的赖氨酸（Lys）残基上添加乙酰基团（-COCH₃）。这种修饰主要发生在组蛋白和非组蛋白上，对基因表达、蛋白质稳定性、酶活性、细胞信号传导等多种生物学过程起着重要的调控作用。目前已经有很多蛋白已经开发出来了相应的特异性乙酰化抗体，直接用特异性乙酰化抗体进行WB检测即可（图3所示）。
另外，当想要观察在某个组织中蛋白翻译后修饰的情况，也可以通过免疫荧光来观察。组蛋白甲基化（Histone Methylation）是真核生物染色体上包裹DNA的组蛋白的赖氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）残基被甲基化的翻译后修饰。可通过组蛋白甲基化的特异性抗体，用免疫荧光来观察在组织中组蛋白甲基化的情况（图4所示）。
二
通过泛抗体并结合Co-IP技术检测
即使是抗体开发越来越全面，但并不是所有的蛋白都有相应翻译后修饰的特异性抗体。因此，可通过泛抗体和Co-IP技术来验证某一蛋白发生了翻译后修饰。
2.1 Ub泛素抗体检测泛素化
蛋白质泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，涉及将泛素分子共价连接到特定蛋白质的赖氨酸残基上。泛素化过程：泛素化是一个由三类酶催化的级联反应，包括：E1泛素激活酶首先将ATP的能量用于激活泛素分子，并与泛素形成一个高能硫酯键；E2泛素结合酶（又称泛素载体蛋白）从E1接收激活的泛素；E3泛素连接酶负责识别靶蛋白并催化泛素从E2转移到靶蛋白的赖氨酸残基上，E3酶赋予整个过程高度的特异性，确保正确的蛋白质被泛素化。因此当某个蛋白被泛素化后，会带有一个泛素分子（Ubiquitin, Ub），可以通过Ub的特异性抗体来检测它的泛素化水平。
通过转染Flag-ZEB1表达质粒，用标签Flag抗体（IP抗体）进行富集，然后用Ub泛素抗体以WB方式检测ZEB1的泛素化水平。实验结果显示TRIM26敲低显著抑制了SK-hep-1细胞中ZEB1的泛素化（图5-G）。
2.2 乙酰化泛抗体检测乙酰化
蛋白被乙酰化后，会带有乙酰化赖氨酸残基，乙酰化泛抗体（Anti-Acetylated Lysine）可以识别这些乙酰化赖氨酸残基，因此可以用来检测蛋白乙酰化。
为了评估MCL1在细胞中是否乙酰化，首先免疫沉淀内源性MCL1蛋白，并使用抗乙酰化赖氨酸抗体（文章中为Ac-K）检测其乙酰化；接下来，为了确定负责MCL1乙酰化的上游酶，将Myc-MCL1表达载体与各种赖氨酸乙酰转移酶表达载体共转染细胞，免疫沉淀Myc-MCL1融合蛋白,在测试的五种乙酰转移酶中，p300、p300/CBP相关因子（PCAF）和creb结合蛋白（CBP）诱导了MCL1的乙酰化；然后，Co-IP验证了HeLa细胞内源性水平的MCL1和p300之间的相互作用（图6）。
三
点突变验证修饰位点
当我们需要去验证蛋白翻译后修饰的位点，可以对该位点的氨基酸进行突变，再检测其蛋白翻译后修饰的情况。
PAX7（Paired Box 7）是一种转录因子，主要在肌肉干细胞（卫星细胞）中表达，调控肌肉干细胞的自我更新和分化。PAX7的乙酰化水平受到多种因素的调控，其中MYST1和SIRT2（Sirtuin 2）是两个关键的调控因子。为了验证MYST1、SIRT1、SIRT2能否与PAX7发生结合及PAX7的乙酰化位点。作者Sincennes转染了WT-PAX7、KR-PAX7（突变型K105/193R）、HA-MYST1、HA-SIRT1、SIRT2过表达质粒进细胞，然后用乙酰化泛抗体（文章中为Anti-Acetyl-Lysine）进行富集，然后再通过WB进行检测。结果可以发现，对比野生型WT-PAX7,突变型KR-PAX7的PAX7条带明显减弱，说明乙酰化水平显著下降了。进一步说明MYST1是通过对PAX7的K105/193R进行乙酰化，从而调控其蛋白功能（如图7）。
在上述各种蛋白翻译后修饰中的实验验证所用的检测技术，伯远生物有丰富操作经验和成熟实验体系，为许多科研单位提供过优质的技术服务，欢迎有这方面需求的老师联系我们。
参考文献
[1]Dilutions R A. Acetyl-p53 (Lys382) Antibody[J]. 2010.
[2]Li W, Li F, Zhang X, et al. Insights into the post-translational modification and its emerging role in shaping the tumor microenvironment[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2021, 6(1): 422.
[3]Li X, Yuan J, Song C, et al. Deubiquitinase USP39 and E3 ligase TRIM26 balance the level of ZEB1 ubiquitination and thereby determine the progression of hepatocellular carcinoma[J]. Cell Death & Differentiation, 2021, 28(8): 2315-2332.
[4]Piro M C, Gasperi V, De Stefano A, et al. In Vivo Identification of H3K9me2/H3K79me3 as an Epigenetic Barrier to Carcinogenesis[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(15): 12158.
[5]Shimizu K, Gi M, Suzuki S, et al. Interplay between protein acetylation and ubiquitination controls MCL1 protein stability[J]. Cell reports, 2021, 37(6).
[6]Sincennes M C, Brun C E, Lin A Y T, et al. Acetylation of PAX7 controls muscle stem cell self-renewal and differentiation potential in mice[J]. Nature Communications, 2021, 12(1): 3253.
[7]Zeng X, Chen Z, Zhu Y, et al. O-GlcNAcylation regulation of RIPK1-dependent apoptosis dictates sensitivity to sunitinib in renal cell carcinoma[J]. Drug Resistance Updates, 2024, 77: 101150.