靶向代谢组学（Targeted Metabolomics）属于代谢组学的一个分支，是一种针对性检测特定代谢物的方法。该方法可依据已知代谢途径和代谢物的特定化学性质，选择性地对感兴趣的目标代谢物进行深入分析。在进行靶向代谢组学研究时，科研人员常常会遇到一种情况：所关注的特定物质或物质类别在市场上缺乏成熟的检测手段。针对这一难题，我司推出了定制靶向开发技术服务。定制靶向开发是针对客户关注的某一个物质或某一类物质，结合物质的物理、化学等性质，开发出一套专属的检测方法，实现对目标代谢物的精准定量。
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技术原理
定制靶向开发的基本原理是将标准品作为参考，根据要检测物质的类别，选择特异性的样本前处理方法，优化LC-MS/MS的检测条件，利用多反应监测（MRM）技术对目标代谢物进行准确的定性定量分析。MRM模式即在三重四级杆的第一个质量分析器Q1中选择某一质量的母离子，然后在第二个质量分析器Q2碰撞单元产生碎片离子，在第三个质量分析器Q3分析多个碎片离子。通过使用标准品，定制靶向开发可以绝对定量或半定量目标代谢物。在做定制靶向开发时，可以优化样品制备，减少高丰度代谢物在分析中的优势，实现对低丰度代谢物的检测。相对于高通量代谢组分析，定制靶向开发技术具有特异性强，灵敏度高和定量准确等优势。
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实验流程
定制靶向开发实验流程包括提取方法开发、标品开发、方法考察、样本检测与分析四个步骤。下面对这四步进行详细说明。
1、提取方法开发
提取方法开发包括确定样本量、选择合适提取试剂和提取方式、确定样本是否需要做净化或浓缩等特殊处理。定制靶向开发检测的常见样本类型包括血清、血浆、尿液、组织、粪便、肠道内容物、细胞等，其样本量需要根据目标代谢物及样本特性确定。提取试剂和提取方式的选择需要结合目标代谢物的理化性质和参考文献进行确定。一般极性代谢物用甲醇或乙醇等提取，非极性代谢物用乙酸乙酯、己烷、氯仿等提取。对于少数代谢物，由于在样本中含量较低，或者在质谱中离子化效率低，需考虑样品富集、纯化或进行衍生化处理。
2、标品开发
（1）物质信息的确定
在标品开发前首先要确定目标代谢物的物质信息是否正确。不同网络平台代谢物的名称、CAS号、KEGG号等信息可能存在差异，通常以KEGG数据库（网站为：https://www.kegg.jp/kegg/compound/）和PubChem数据库（网站为：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上的信息为准。以L-精氨酸为例在KEGG数据库和PubChem数据库物质信息如下：
（2）色谱方法开发
色谱方法开发首先需要根据目标代谢物的理化性质选择合适的色谱柱类型，一般为C18色谱柱，个别物质可能会用到氨基柱、糖柱等其它类型的色谱柱。其次需要根据目标代谢物的酸碱性等选择合适的流动相和梯度体系，一般酸性代谢物，流动相中会添加甲酸、乙酸等；碱性代谢物，流动相中会添加氨水等；对酸碱敏感的代谢物，在流动相中会添加缓冲盐。
（3）质谱方法开发
三重四级杆质谱方法开发首先需要确定母离子Q1和碎片离子Q3等信息。由于母离子有很多加合形式，如质子、钠离子加合等，所以在确定母离子时，需要考虑目标物的电离特性。确定母离子后，通过调节碰撞能CE可确定碎片离子Q3，即子离子。然后通过优化碰撞能CE、去簇电压DP等参数，提高子离子的响应。此外，如果想用内标法对目标代谢物定量，还需确定合适的内标。
3、方法考察
提取方法和检测方法开发完成后，需要进行方法考察来确定方法的可行性和准确性。一般完整的方法考察包括标准曲线、回收率、日内日间精密度、检出限、定量限等。但定制靶向开发考虑客户需求及成本，一般默认只做标准曲线，标准曲线相关系数达到R＞0.99，确保数据的准确性。
4、样本检测
方法考察完成后即可按照前面开发的方法对样本进行目标代谢物的检测。在检测过程中我司会通过技术重复、混标质控来确保项目定量的准确性。
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定制靶向开发在人类疾病中的应用
代谢物在维持生命活动中起着至关重要的作用。代谢物的异常与癌症、糖尿病、高血压、神经性疾病、阿尔茨海默病等多种疾病的发生发展密切相关，目前科研人员对这些异常代谢物的研究仍处于前期阶段，尚有大量疾病相关代谢物未被开发，而这些异常代谢物大多亟需定制靶向开发，下面列举了定制靶向开发在人类3种疾病中的应用案例。
1、神经退行性疾病
2023年9月7日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室周海波团队在Nature Metabolism（IF：18.9）上发表了题为“Alleviating symptoms of neurodegenerative disorders by astrocyte-specific overexpression of TMEM164 in mice”的研究论文。在本研究中，作者通过RNA-seq、靶向代谢组等技术发现TMEM164作为跨膜蛋白，是一个调节神经毒性星形胶质细胞反应性的早期反应内在因子。体外实验表明，过表达TMEM164能够抑制神经毒性反应性星形胶质细胞功能，维持正常星形胶质细胞功能，并减少神经毒性饱和脂质的分泌，抑制神经毒性反应性星形胶质细胞介导的神经元死亡。同样的，体内实验数据显示，通过腺相关病毒介导在雄性和雌性小鼠中过表达TMEM164，可阻止神经毒性反应性星形细胞的形成，多巴胺能减缓神经元的损失和帕金森病模型中的运动障碍。
2、肿瘤
2020年8月19日，美国威尔康奈尔医学中心John Blenis和Ana P. Gomes团队在Nature（IF：50.5）上发表了题为“Age-induced accumulation of methylmalonic acid promotes tumour progression”的研究论文。在本研究中，作者通过蛋白质组学、靶向代谢组学、全转录组学、分子生物学验证等技术发现随着年龄增长，代谢改变会产生有利于肿瘤进展和侵袭的系统环境。丙二酸代谢的副产物甲基丙二酸（MMA）在老年人的血清中上调，并可作为肿瘤进展的中介物。这是由于MMA诱导SOX4的表达，从而引发转录重编程，促进了癌细胞的侵袭和转移。本研究揭示了MMA是衰老和肿瘤发展之间的代谢联系纽带，也是晚期癌症治疗中的潜在作用靶点。
3、糖尿病
2023年9月21日，北京协和医院中医科梁晓春团队在Journal of Pharmaceutical Analysis（IF：6.1）上发表了题为“Targeted metabolomics reveals the aberrant energy status in diabetic peripheral neuropathy and the neuroprotective mechanism of traditional Chinese medicine JinMaiTong”的研究论文。在本研究中，作者通过靶向代谢组学对56种代谢物进行分析，发现糖尿病周围神经病变的能量代谢异常涉及多条代谢途径，其中以TCA和糖酵解的改变最为显著。中药筋脉通可通过激活AMPK/PGC-1α通路，改善能量代谢等多个途径，缓解糖尿病周围神经病变症状并减轻周围神经损伤。本研究为筋脉通的临床应用提供了新的依据，对开发新的糖尿病周围神经病变治疗策略具有重要价值。
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小医叨叨
目前有大量疾病相关代谢物未被开发，而这些代谢物大多亟需定制靶向开发。而定制靶向开发仍处于发展阶段，面临诸多挑战，如提高检测灵敏度、开发通用的检测方法、实现无偏性的定量分析以等。但定制靶向开发随着技术的不断进步和创新，将为我们对生物体内代谢过程的理解和治疗方法的开发带来新的视角和工具。
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我司优势
伯远医学拥有一流的技术团队、丰富的项目经验，提供一站式定制靶向开发技术服务，您只需提供目标代谢物的标准品和待检测样本，伯远医学即可为您提供项目方案，进行目标代谢物的方法开发和检测。
1、定性准：利用标准品对目标代谢物进行定性定量，参考标准品的二级谱图确保了对目标代谢物的精确识别。
2、定量准：利用标准曲线定量，确保每个项目的定量结果准确。
3、重现性好：采用MRM技术通过筛选目标物质的前体离子和特征碎片离子，有效排除非目标离子干扰，使定量更为精确，重复性更好。
4、质控严格：采用严格的QC系统，保证每个项目的定性定量结果。
5、灵敏度高：基于TSQ Altis Plus LC-MS/MS，灵敏度可达pg级。
6、经验丰富：开发团队具有能量代谢、氨基酸、胆汁酸、脂肪酸等靶向物质开发经验。
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样品要求
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试验周期及交付结果
1、实验周期为1-3个月不等，具体以评估为准。
2、交付结果包括：完整的结题报告和实验原始数据。
参考文献
1.Liansheng Z , Zhiheng J, Qiang W, et al. Alleviating symptoms of neurodegenerative disorders by astrocyte-specific overexpression of TMEM164 in mice[J]. Nature Metabolism, 2023, 5(10): 1787-1802.
2.Ana P. G, Didem I, Vivien L, et al. Age-induced accumulation of methylmalonic acid promotes tumour progression[J]. Nature , 2020, 585: 83–287.
3.Bingjia Z , Qian Z , Yiqian H, et al. Targeted metabolomics reveals the aberrant energy status in diabetic peripheral neuropathy and the neuroprotective mechanism of traditional Chinese medicine JinMaiTong[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2023, 14(2):225-243.
