在分子生物学领域，生物分析技术的进步是揭示生物分子间相互作用机理的关键。随着科学家们在这一领域不断深入研究，他们已经开发出多种技术手段，如免疫技术、X射线晶体衍射、核磁共振波谱学等，这些方法在理解分子间相互作用方面发挥了重要作用。1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）理论首次被提出，为研究者提供了在1.0-6.0nm范围内精确测定分子间相互作用的新方法。1967年，FRET理论得到实验验证，这一距离范围被称为“光学尺”，标志着分子生物学研究的重要里程碑。进入八十年代，FRET技术应用于蛋白质结构研究，并与其他技术手段结合，推动了分子生物学检测手段的发展。FRET技术的出现和应用，为分子生物学和生物医学领域提供了新的视角和深远影响。

▲分子间或分子内FRET作用示意图（Markova., 2008）

一、FRET荧光共振能量转移的简介及原理

FRET荧光共振能量转移，是一种精妙绝伦的生物物理现象，如同一位在微观世界翩翩起舞的舞者，基于分子间距离和方向依赖性进行能量传递。其基本原理是，当两个荧光分子——供体（Donor）和受体（Acceptor）在1-10nm的空间距离时，供体分子被激发后，如果其发射光谱与受体分子的吸收光谱有重叠，供体可以通过非辐射的方式将能量传递给受体。这种能量转移会导致供体荧光强度的减弱和受体荧光强度的增强，从而可以用来研究分子间的相互作用、距离和构象变化等生物化学过程。

图1 FRET的原理（Chen T et al., 2019）

FRET技术在生物医学研究中具有广泛的应用。例如，它可以用来研究蛋白质之间的相互作用、DNA的复制和修复过程、细胞信号传导途径以及药物与靶标蛋白的结合情况。通过将供体和受体荧光标签分别连接到感兴趣的分子上，研究人员可以实时监测这些分子在细胞内的动态变化和相互作用。

二、FRET荧光共振能量转移的发生条件

一个理想的FRET相互作用体系，要有一对合适的荧光物质，目前，较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP，CFP-YFP-mCherry等，染料类有Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine等，并且这些荧光物质要能够标记在研究对象上。此外，还要遵循以下原则：

1.能量匹配：供体分子所释放的发射光谱必须能够被受体分子有效吸收，并因此产生荧光信号。为确保能量转移的有效性，供体分子的发射光谱与受体分子的激发光谱之间必须存在显著的重叠区域，这一重叠比例应大于30%。

2.作用距离限制：供体分子与受体分子之间的相互作用距离受到严格限制，通常应在1-10nm的范围内。这一距离范围是确保分子间能量有效传递的关键因素。

3.偶极-偶极相互作用：供体分子在发射态下的偶极矩与受体分子在吸收态下的偶极矩，以及它们之间的相对向量方向，必须满足特定的条件。这些条件对于实现分子间的有效偶极-偶极相互作用至关重要。

图2 FRET发生的条件（Lim J et al., 2022）

三、FRET荧光共振能量转移的实验步骤

以荧光蛋白CFP（供体）和YFP（受体）为例，检测X和Y两个蛋白在细胞内的相互作用情况。具体步骤如下：

1.细胞培养：首先，根据实验需求，选择并培养特定类型的细胞，以便进行后续的转染操作;

2.细胞转染：构建两个质粒载体，将要检测的X和Y蛋白分别偶联上CFP和YFP荧光蛋白，形成融合蛋白，并命名为CFP-X和YFP-Y。然后，将这两个质粒共转染到已经培养好的细胞中，进行后续检测；

3.FRET检测：在质粒载体CFP-X和YFP-Y转染细胞后，分别在10h、12h、18h、24h、36h、48h和72h进行检测，以确定是否发生了FRET现象。这一过程需要仔细监控，以确保在适当的时间点进行检测；

4.FRET图像采集：为了准确采集FRET信号，首先需要确定FRET配对的激发波长。调谐蓝光分别用于探测最大和最小的供体和受体信号，最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的FRET信号。调整激光变化，以获取最大CFP信号和最小YFP信号的激发光波长，随后，采集供体和受体图像，并收集FRET信号。对于每个细胞，重复进行3次FRET检测，确保结果的准确性。对于每种转染，至少完成6个细胞的FRET检测，以获得足够的数据进行分析；

5.FRET数据处理：在收集到FRET信号后，对数据进行处理，去除FRET信号中的光谱串色信号，如供体的直接激发（DSBT）和受体的直接激发（ASBT）；对受体通路的FRET信号进行供体和受体光谱灵敏度、自发荧光和光学噪声的矫正；利用矫正系数对双标记细胞进行像素匹配矫正，以确保数据的准确性。通过这些步骤，我们可以获得更加精确和可靠的FRET数据，进而分析XY蛋白在细胞内的相互作用情况。

该实验技术的难点就在于FRET信号图像采集和数据处理。

四、FRET荧光共振能量转移的优缺点

优点：

1.实时监测：FRET可以在活细胞内进行实时监测，从而观察生物分子在正常生理状态下的动态变化和相互作用。

2.高灵敏度和高空间分辨率：FRET能够在分子尺度上提供距离信息，可以检测到纳米级别的距离变化，实现对单细胞水平的研究。

3.可以进行多色标记。

4.可以与多种仪器和技术联用：例如显微镜、色谱技术、电泳以及流式细胞技术等，提供多样化的研究手段。

缺点：

1.应用局限且有距离限制：通常需要在待检测的分子上偶联荧光物质进行标记，这种标记过程可能会对分子的正常功能产生影响。FRET信号强度受距离限制，只有供体和受体之间的距离在1-10nm范围内才能检测到有效的能量转移，这限制了其在更大距离范围内的应用。

2.对实验条件敏感：FRET信号可能受到多种因素的影响，如供体和受体的浓度、pH值、温度和离子强度等。

3.荧光背景干扰，存在假阳性：供受体的光谱重叠不好或复杂的生物样本中有其他背景荧光，都可能导致荧光干扰，影响实验结果的可靠性。

4.供体和受体的选择有限：合适的荧光分子数量有限，且每种分子有其特定的光谱特性和生物相容性。

参考文献

1.Chen T, He B, Tao J,et al.Application of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) technique to elucidate intracellular and In Vivo biofate of nanomedicines[J].Advanced Drug Delivery Reviews, 2019, 143.DOI:10.1016/j.addr.2019.04.009.
2.Lim J, Petersen M, Bunz M, et al. Flow cytometry based-FRET: basics, novel developments and future perspectives[J]. Cell Mol Life Sci. 2022 Mar 30;79(4):217. doi: 10.1007/s00018-022-04232-2.

3.Markova O .FLUORESCENT BIOSENSORS FOR LIVE CELLS ANALYSIS[J]. 2008.DOI:10.13140/RG.2.1.2841.5124.