血浆与血清作为最主要的临床样本，是评估人类健康和疾病状态的理想生物标本，方便采集。血浆中的蛋白质来源于身体各个组织和脏器，并通过血液循环流经全身，可动态反应各种疾病问题。血浆蛋白质参与生命体的生长、修复、信号传导、运输和机体免疫等关键生命活动，会伴随疾病的发生、发展并呈现出差异化的表达水平调控。因此，深入研究血浆蛋白质组对疾病诊断和疗效监控具有重要的意义。
然而，由于血浆与血清蛋白质组的复杂性和独特性：（1）蛋白质种类超过2万种，其中前22种高丰度蛋白质比例高达99.5%，包括白蛋白、lgG、lgA、纤维蛋白原、转铁蛋白、触珠蛋白、抗胰蛋白酶等。而质谱对于蛋白肽段信号的检测倾向于高丰度，因此往往即使最高分辨率的质谱仪也无法检测到0.5%的蛋白；（2）蛋白质浓度动态范围（Concentration Dynamic Range）横跨12个数量级，从最高的白蛋白到丰度低于pg/mL的细胞因子，能同时检测如此宽动态范围的蛋白组对于找到生物标志物至关重要。在目前研究中，血浆中的低丰度蛋白（通常低于10ng/mL）往往是疾病特异性生物标志物，如果不在检测之前去除高丰度蛋白质，低丰度蛋白质在其信号压制下将很难被检测到，导致我们过去无法利用现有技术（如LC-MS）实现对血浆蛋白质组的无偏差、高深度分析。“看”不到更“多”更“深”的血浆蛋白，蛋白质分子标志物的筛选就无从谈起。但随着新技术的发展，从样本制备技术上的提升–基于选择性亲和纳米探针技术实现广谱、无偏差的富集，更高灵敏度检测的蛋白质组平台Astral，更低检测浓度，让高深度血浆蛋白质组成为鉴定蛋白质分子标志物的利器。从血浆中筛选和发现与生理/病理相关的蛋白质分子标志物（Biomaker）是长期的研究热点。
▲ 超多重蛋白标志物发现系统
血浆/血清蛋白质组与细胞/组织蛋白质组存在巨大差异
对于细胞/组织样本，其蛋白质组的动态分布范围小（~7log），运用当下基于质谱（LC-MS）的蛋白质组学技术（如SILAC、iTRAQ/TMT，label-free、DIA/SWATH等），能实现对样本中几千~上万种蛋白质的鉴定/定量分析。
对于血浆/血清样本，由于其蛋白质组的高动态范围（10log）和高丰度蛋白的强烈干扰，即使通过高丰度去除（Depletion）和组分分离（Fractionation）等复杂流程，最终通过LC-MS检测也仅能“看”到几百个蛋白，覆盖度（Coverage）不到血浆蛋白质组的10%，远远落后于细胞和组织蛋白质组的研究。
为了提高对血浆蛋白组的质谱鉴定覆盖度，高丰度蛋白去除（Abundant Protein Depletion）是必要步骤。然而在高丰度去除过程中往往存在去除偏差性，原因如下：
1、现有商品化去除试剂无法完全去除血浆中的高丰度蛋白（~95%），剩余的部分依然是高丰度，仍然严重干扰质谱对其它低丰度蛋白的检出；
2、高丰度蛋白去除过程中也会去除一些与高丰度蛋白互作的蛋白质，导致重要蛋白质信息的损失；
3、即使按照图1所示的复杂流程，通过一次实验，也仅能鉴定/定量几百个血浆蛋白（覆盖度<10%血浆蛋白质组），无法实现高深度覆盖。不能“看”到更“深”的血浆蛋白，则下游的开发和应用无从谈起。
图1 主流血浆/血清蛋白质组分析技术流程示意图。
去除高丰度蛋白的方法
那么如何去除高丰度蛋白呢？目前常用的去除高丰度蛋白的方法又有哪些呢？别急，小医已经精心为大家整理好了，一起来学习下吧！
去除高丰度蛋白可分为低丰度蛋白富集（如利用纳米富集磁球）和高丰度蛋白去除（抗体试剂盒）两类，具体试剂盒产品如下：
1、ProteoExtractTM高丰度蛋白去除试剂盒（德国默克公司）
该试剂盒提供了一种快速、可重现且高度特异性的方法，可同时去除血浆或血清等体液样本中的血清白蛋白和IgG，使样品复杂性显著降低，可检测低丰度蛋白。该试剂盒中每个柱子含有亲和树脂混合物，该树脂混合物能与血清白蛋白和IgG高度特异性结合，与其他血清蛋白的结合度非常低。每根柱子能去除血浆中80%的血清白蛋白和IgG，每个柱子吸附量高达2mg白蛋白和0.7mg IgG。
2、Proteominer（bio-rad公司）
该方法的原理是通过一个六肽配基与高丰度蛋白结合，从而进行去除。这种方法是非抗体型的，没啥特异性，它不受物种限制和样品类型限制。当样品进来时，六肽配基会优先结合丰度高的蛋白质，丰度低的结合的机会小很多，于是就达到了分离去除的目的。
3、ProteographTM
该方法是Seer公司推出的基于超顺磁性纳米表面进行功能化修饰，使得血浆中的低丰度蛋白质能够在纳米尺度空间富集，通过高分辨质谱在肽段层面鉴定蛋白质。
4、ProteonanoTM
该试剂盒是Nanomics公司推出的低丰度血浆蛋白富集的试剂盒，其与其他试剂盒的区别在于去除高丰度的方法。Proteonano™是基于选择性亲和超顺磁性纳米探针的技术，每个纳米探针直径仅为200nm，并且具有绝对均一性。其表面通过化学偶联反应蛋白质富集探针（AI算法设计和改造的miniprotein），每个纳米磁珠表面约有300000个蛋白质结合位点用于富集人类蛋白质组。每个纳米探针物理空间仅为10飞升，比传统蛋白检测体系小了100亿倍，这使得对低丰度蛋白质的检测灵敏度提升100万倍。不仅有限防止去高丰度方式导致的样本信息流失，更有利于保存低丰度蛋白，并且试剂性能远超去高丰度方式。
图2 Proteonano™ VS Neat&去高丰度技术10000倍检测深度提升。
5、Thermo Fisher Scientific公司的High-Select™ Top14 Abundant Protein Depletion Resin
该试剂盒通过高丰度蛋白去除中型离心柱去除高丰度蛋白。High Select HSA/免疫球蛋白去除树脂使用高特异性固定化抗HSA和抗免疫异球蛋白抗体（IgG、IgA、IgM、IgD和IgE）去除血清和血浆中的人血清白蛋白（HSA）以及所有主要亚类免疫球蛋白。
伯远优势
▲伯远引进赛默飞全新一代Orbitrap Astral质谱仪
与传统质谱分析方法相比，伯远Astral质谱平台+的更多优势体现在以下几点：
1、无需对血浆蛋白进行高丰度去除，从而保留血浆蛋白质组的全部信息价值；
2、全自动化进程，一次实验可同时分析96个样本，从富集到获得酶解肽段仅需7个小时；
3、无需对酶解肽段进行馏分分离（Fractionation），极大提高整体流程效率；
4、下游质谱测试时间短，DDA模式：8-14min/sample，DIA模式：8-14min/sample；
5、可稳定、快速实现上万个样本级别的大队列（Cohort study）血浆样本的分析，驱动血浆蛋白质分子标志物的筛选、发现和应用。
图3 伯远实测案例展示1
图4 伯远实测案例展示2
近日伯远生物与珞米生命科技达成深度战略合作，联合推出中国高深度血浆/血清蛋白质组学——高通量，高灵敏度，高准确性，高性价比，短周期的解决方案。欢迎致电咨询4000270273，伯远生物官网：www.biorun.com。
文献案例展示
例子一
2024年1月8日，首都医科大学贾建平教授、西湖大学郭天南教授、浙江大学吴志英教授共同通讯在Innovation（IF：32.1）上发表了题为“Alzheimer’s disease early diagnostic and staging biomarkers revealed by large-scale cerebrospinal fluid and serum proteomic profiling”的研究性文章，团队开发了用于阿尔茨海默病（AD）早期诊断的两个蛋白质组（Panel），分别由19种脑脊液（CSF）蛋白和8种血清蛋白组成，为AD血液检测在临床筛查和分期中的应用奠定基础。为了探索AD的早期诊断和分期生物标志物，团队对发现队列中配对的CSF和血清样本进行了TMT蛋白质组学分析，量化了3238种CSF蛋白和1702种血清蛋白。过滤掉缺失率超过80%的蛋白质后，剩下2461种CSF蛋白和1330种血清蛋白，两种样本蛋白质基质的缺失值均为0.19，确定了CSF和血清中潜在的AD早期诊断和分期生物标志物（图5）。
图5 本研究图形摘要示意图（Tao et al., 2024）。
例子二
2023年12月6日，美国斯坦福大学Tony Wyss-Coray团队在Nature（IF：64.8）上在线发表题为“Organ aging signatures in the plasma proteome track health and disease”的研究性文章，团队利用源自特定器官的人类血浆蛋白水平来测量活体个体器官特异性的衰老差异，团队分析了11个主要器官的衰老情况，并在包含5676名成年人的5个独立队列中重复估计了人类一生中的器官年龄。结果发现，近20%的人口显示出某一器官的衰老速度明显加快，而1.7%的人口则出现多器官衰老现象。器官加速老化导致死亡风险增加20-50%，而器官特异性疾病与这些器官的加速老化有关。同时，团队还发现心脏老化加速的个体心力衰竭风险增加250%，大脑和血管老化加速可预测AD进展，且与血浆pTau-181（目前最好的AD血液生物标志物）一样强。该模型将血管钙化、细胞外基质改变和突触蛋白脱落与早期认知能力下降联系起来，介绍了一种简单且可解释的方法，利用血浆蛋白质组学数据研究器官衰老，预测疾病和衰老效应（图6）。
图6 血浆蛋白可以模拟器官衰老（Oh et al., 2023）。
例子三
2023年10月16日，上海交通大学赵健元、复旦大学丁琛、孙锟及赵瑞共同通讯在EMBO Molecular Medicine（IF:11.1）上在线发表题为“Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease”的研究性文章，团队通过招募103名健康后代的孕妇和104名先天性心脏病（CHD）后代，旨在对患有和不患有CHD胎儿的妊娠早期孕妇的血浆蛋白进行蛋白质组学分析，以全面鉴定新型诊断生物标志物。团队通过收集孕早期血浆并进行血浆蛋白质组学分析，以期确定妊娠早期（妊娠10-12周）母体血浆中CHD的生物标志物，并建立分子产前诊断方法。研究发现，在显著改变的蛋白质中，CHD患者的25个上调的蛋白质在氨基酸代谢、细胞外基质受体和肌动蛋白骨架调节方面富集，而49个下调的蛋白质在碳水化合物代谢、心肌收缩和心肌病方面富集，提示血脂异常和CD4+可能与冠心病的发生有关，并鉴定出九种与CHD相关的生物标志物（图7）。
图7 本研究图形摘要示意图（Yin et al., 2023）。
参考文献
Oh HS, Rutledge J, Nachun D, et al. Organ aging signatures in the plasma proteome track health and disease. Nature. 2023;624(7990):164-172.
Tao QQ, Cai X, Xue YY, et al. Alzheimer’s disease early diagnostic and staging biomarkers revealed by large-scale cerebrospinal fluid and serum proteomic profiling. Innovation (Camb). 2024;5(1):100544.
Yin YN, Cao L, Wang J, et al. Proteome profiling of early gestational plasma reveals novel biomarkers of congenital heart disease. EMBO Mol Med. 2023;15(12):e17745.