B细胞和T细胞等免疫细胞是人体抵御感染和抗肿瘤的核心，它们表达独特的受体以特异性识别外来威胁。免疫细胞受体的多样性极高，每个人体内都有数十亿个具有不同受体的免疫细胞。
免疫细胞克隆的空间分析可以将特异性抗原受体与肿瘤相关抗原、自身抗原或外源抗原联系起来，这可能有助于识别和利用抗原特异性克隆进行治疗。但是，“使用以前的方法在微环境中同时定位B细胞和T细胞受体是不可能的”，卡罗林斯卡学院的Camilla Engbom这样说。
单细胞技术允许在细胞水平上研究抗原受体，但是缺乏空间信息；而现有空间转录组学（ST）方法却无法保留全长抗原受体转录本，因为制备文库时会破坏淋巴细胞克隆关键信息互补决定区（CDR3）。可以说，没有一种方法能够全面地绘制B/T细胞抗原受体全长序列以及它们的谱系关系。
近期，卡罗林斯卡学院和KHT皇家理工学院的科学团队在《科学》杂志发表新研究成果，他们在Visium空间转录学（Spatial GEX）的基础上开发了VDJ序列空间转录组学（Spatial VDJ），可同时捕获人类组织中的B细胞和T细胞抗原受体序列、并揭示细胞克隆动态，为研究感染、疫苗接种以及癌症的免疫反应提供了新的工具。
论文题图
在人类扁桃体的GEX文库中，其实可以观察到足够的B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）表达，但是它们在整个文库中的占比较小。研究者认为，在进行片段化步骤之前，可以从Visium cDNA中PCR扩增CDR3序列，对这部分包含空间信息条码的序列进行测序，是一种可行的确定抗原受体转录本克隆和位置的方法。
研究者开发了两个不同版本的Spatial VDJ，长读（LR）版可生成全长的免疫球蛋白（IG）和T细胞（TR）抗原受体转录物文库；短读（SR）版仅用于TR序列，使用CDR3相邻的V引物进行两步半巢式PCR扩增。两种方法都使用针对TR和IG恒定区的杂交捕获探针来富集抗原受体转录本，同时保留空间条形码、唯一分子标识符（UMI）和全长受体序列。
研究者首先在人类扁桃体组织中测试了LR和SR Spatial VDJ的效果，共鉴定出62533个独特的IG和TR克隆序列。从可视化分布图中可以看出，LR和SR检索到的克隆序列具有重叠的空间分布，表明二者的结果是有可比性的。
对人类扁桃体进行Spatial VDJ
抗原受体在扁桃体基因表达谱中的分布并不均匀，在标记为同型转换细胞、鳞状上皮细胞和B细胞滤泡/生发中心的组织区域中，IG克隆计数最高。TR克隆计数则在T细胞相关区域最高。
研究者比对了Spatial VDJ和Spatial GEX数据集，抗原受体链表达是一致的。研究者使用Stereoscope模型对GEX数据反卷积来推断细胞类型分布，数据也是匹配的。可以认为，Spatial VDJ能够有效描述特性B细胞和T细胞克隆的空间分布，与典型的次级淋巴组织结构和细胞分布一致。
接下来，研究者在人类乳腺癌组织中测试了Spatial VDJ的效果，针对两个未经治疗的HER2阳性乳腺肿瘤（P1和P2）分别生成Spatial GEX和VDJ文库；为了更好地分析瘤内异质性，研究者还将活检组织分为多个区域，均包含肿瘤、肿瘤边界和临近的非肿瘤组织，最终鉴定得到每个患者数千个独特的IG克隆序列和数百个TR序列，其中瘤外区域发现的不同克隆数量最多。
分析乳腺癌组织
扩增的肿瘤浸润B/T细胞克隆代表潜在的局部抗原特异性相互作用和抗肿瘤能力，研究者尝试寻找这部分细胞。用过去的方法是难以在表型丰富的淋巴细胞中找到直接与肿瘤相互作用的亚群的，但是使用Spatial VDJ联用单细胞VDJ RNA测序，匹配活检数据，可以清楚发现扩增的T细胞克隆更富集于肿瘤边界。
扩增的T细胞克隆更富集于肿瘤边界
为了预测抗原受体配对，研究者开发了一个名为repair计算框架，并在P1上进行了测试，结果显示精确度最高可以达到95.8%。不同的IG受体对在肿瘤内不同区域分布，研究者认为Spatial VDJ+repair的组合可以用于预测人体组织中成对的新生IG受体，为筛选肿瘤相关抗体提供了方便。
最后，研究者还使用Spatial VDJ分析了B细胞发育谱系，揭示了不同B细胞滤泡/生发中心内部和之间的B细胞克隆家族多样性，在确定了谱系树的同时，还能够追踪B细胞的空间位置扩散。
B细胞发育树
Spatial VDJ的性能受检测材料质量、淋巴细胞丰度、组织与Visium方案相容性、抗原受体表达水平、克隆细胞计数和克隆组织分布影响，对非扩增克隆或抗原受体表达水平低的克隆，Spatial VDJ的性能还有不足。而由于TR链配对数据的缺乏，目前的repair框架还不能完成TR相关的匹配。
但相对现有技术，Spatial VDJ提供了一种全新且较为简单的解决方案。研究者认为，Spatial VDJ能够在感染、疫苗接种、癌症研究中起到重要作用，为阐明未知的免疫机制提供帮助，更可以用于抗原特异性克隆筛选并应用于工程细胞或基于抗体的治疗。
参考资料：
[1]https://www.science.org/doi/10.1126/science.adf8486
