蛋白质翻译后修饰（PTMs）在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更复杂，功能更完善，调节更精细，作用更专一。蛋白翻译后修饰包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羟基化、脂酰化、羧基化等共价修饰（具体可参见“带你了解关于蛋白质翻译后修饰的简单介绍”一文）。其中，蛋白磷酸化是最常见、最重要、研究最多的翻译后修饰，它在每个生物的各个方面都扮演着重要的角色，例如基因转录、表达、细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、免疫调控、肿瘤发生等。
一、蛋白磷酸化简介
蛋白质磷酸化是指在蛋白激酶催化作用下，把来自三磷酸腺苷（ATP）γ位的磷酸基团共价连接到底物蛋白氨基酸残基（丝氨酸(~86%)、苏氨酸(~12%)或酪氨酸(~2%)）上，被激酶去除并被磷酸酶去除的过程。该过程是可逆的，催化蛋白质发生磷酸化的酶被称为蛋白激酶（Protein Kinase, PK），而催化蛋白质去磷酸化的酶被称为蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase, PPase）。磷酸化可以改变蛋白质的结构、功能和相互作用，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。因此，磷酸化在体内平衡和疾病的几乎所有细胞过程中都起着至关重要的作用。更重要的是，不同残基的磷酸化会导致不同的结果。例如，RAF1是MAPK通路的核心激酶，当它在丝氨酸（S）或苏氨酸（T）残基S259、S338、S340/341、T491或S494处发生磷酸化时会被激活。然而，在S289/296/301发生磷酸化则会导致RAF1激酶活性的抑制。因此，了解磷酸化的特定位点和水平对于了解细胞信号传导和表型至关重要。
图1 磷酸信号网络：蛋白质磷酸化和去磷酸化过程（Fatima A et al., 2017）。
蛋白质磷酸化的分析和磷酸化位点的鉴定已成为目前蛋白质组学研究的关注点之一，评估蛋白磷酸化在信号通路研究和多种细胞生物学活动中必不可少。目前蛋白质磷酸化的检测方法主要有特异性抗体、32P放射性标记、质谱、ELISA和流式细胞术等。每种方法都有其各自的优缺点，因此需要在不同的背景和情况下精心挑选最适合的检测方法，才能最好的服务于要解决的科学问题。接下来，伯小医就带领大家了解一些评估蛋白磷酸化最常用的方法，以便大家在实验中更好的选择。
二、蛋白磷酸化的检测方法
1.Western blot（WB）
WB是定性检测蛋白磷酸化水平的金标准，是评估蛋白磷酸化状态最常用的方法。基本过程是经过SDS-PAGE分离出蛋白样本后，进行转膜，通常是转移到PVDF或尼龙膜上，然后孵育磷酸化位点特异性抗体及辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，添加HRP底物后，即可检测到抗体结合的磷酸化蛋白质。因为只有被磷酸化修饰的蛋白才会在相应分子质量的地方显现特异性蛋白条带。
很明显WB的灵敏度和特异性取决于所使用的抗体。许多磷酸化特异抗体十分灵敏，可轻松检测常规样品（如10~30μg细胞提取物）中的磷酸化蛋白。如果抗体与样品中的其他蛋白质发生非特异性结合，将会影响结果的判读。另外，由于测得的磷酸化蛋白水平可能随时间处理或凝胶上样的误差而出现偏差，所以研究人员通常会利用一个针对目的蛋白总蛋白水平的抗体来平行检测（即洗脱磷酸化抗体后再用同一张膜进行第二次检测）该蛋白的总水平（而不考虑磷酸化状态），以确定磷酸化组分的相对比例是否有变化，并作为上样内对照。
WB检测方法的特点：
WB方法简便，只需化学发光成像仪即可，一般实验室都具备这个条件；特异性好，分辨率高，可以识别特定的磷酸化位点，但特异性磷酸化抗体难以制备，导致许多特异性位点的磷酸化检测受限；操作比较复杂，通常需要1~2天，不适合大量样本，适用于单个蛋白磷酸化检测；测定的磷酸化水平受样品处理和凝胶上样的误差影响；对于丰度低的蛋白，可以先通过IP使用目标蛋白的抗体对目标蛋白进行富集，再进行WB检测被磷酸化的蛋白，检测效率可以提高几倍甚至几十倍。
图2 WB检测小鼠初级神经元细胞中P-AKT（S473和T308）、AKT、P-TSC2（T1462）和TSC2表达量（Festa BP et al., 2023）。
2.32P同位素放射性标记法
直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，经过SDS-PAGE分离，识别电泳凝胶上的同位素蛋白点来检测。32P同位素放射性标记法，即体内代谢培养，用32P同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有32P同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，即可用放射自显影检测到磷酸化蛋白质。
32P同位素放射性标记法的特点：
该方法操作简单，适用于蛋白磷酸化位点检测以及单个蛋白磷酸化检测，能提供具有生物学意义的确切磷酸化位点；但放射性标记只能在细胞中应用，具有局限性，且存在放射性危险。
3.质谱（MS）
复杂的生物样品（如细胞裂解液）中蛋白质磷酸化的全面评估（磷酸化蛋白质组学）或单个蛋白磷酸化位点鉴定和分析，对于分析磷酸化相关信号通路网络以及药物靶点鉴定非常重要。目前，依靠高精准度质谱仪，快速准确地分析细胞中高丰度蛋白的磷酸化修饰已是非常简单的事。磷酸化蛋白质组学分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定，以及磷酸化残基的测序。主要流程是通过SDS-PAGE胶，或者2D-PAGE胶等分离目标蛋白，把含有目标蛋白的条带切下来，使用胰酶消化，根据MS“自下而上”的方法，蛋白质被消化成肽，最后经过LC-MS/MS检测分析蛋白序列和相应位点的磷酸化修饰。对于磷酸化丰度相对较低的目标蛋白，可以通过固定化金属亲和层析（IMAC）、TiO2亲和层析、泛磷酸化抗体富集等方法提高磷酸化肽段的比率，提升磷酸化肽段的检测范围后，再进行质谱分析。
MS的特点：
设备要求高，精准度高，能够同时检测多个蛋白的多个磷酸化位点；不依赖于磷酸化抗体，可以识别新的磷酸化事件；动态范围高达5个数量级，能够在较低浓度下检测磷酸化蛋白；适用于大规模分析蛋白磷酸化水平，但测序结果分析相对复杂，需要依赖专业分析软件，以及生物信息技术平台。
图3 包含磷酸化在内的多种PTM质谱分析流程图（Pascovici D et al., 2019）。
4.ELISA
随着高灵敏度抗体对（如兔来源的单克隆抗体对）的研发和推出，ELISA也成为测定蛋白磷酸化的有力方法，为研究信号通路中涉及的细胞内蛋白的研究人员提供了有力支持。一般采用传统的夹心法ELISA或基于ELISA抗体对的类似分析平台进行分析。传统夹心法ELISA使用两种抗体检测目的蛋白，一种抗体捕获目的蛋白，另一种抗体检测目的蛋白，而磷酸化蛋白使用ELISA检测，是一种抗体结合总蛋白，而另一种抗体结合磷酸化位点。基本流程是将目的蛋白的特异性捕获抗体（与磷酸化状态无关）包被在分析板中，加入样品（细胞裂解液或者纯化的蛋白）孵育，洗涤去除未结合的物质，然后加入磷酸化位点特异性抗体，再加入酶标二抗，最后加入底物和终止液，酶标仪读取吸光度。因样品中磷酸化蛋白的含量不同，溶液会呈现出不同程度的颜色，吸光度水平与检测到的目的蛋白量成正比。
此外，基于细胞的ELISA也被开发出来，能够在完整细胞的背景下测定蛋白磷酸化。细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断，也可在同一个孔中同时检测磷酸化蛋白和总蛋白。因此，来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估。
ELISA的特点：
操作简单，分析快速，只需使用酶标仪读取数据，一天内就能完成；使用两个抗体特异性更高，灵敏度也高，允许使用更少量的样品，检测低丰度蛋白；通过校准的标准品可以轻松对定量；可以做到高通量，也可以进行多重分析（即多个位点磷酸化的同时分析）。
图4 ELISA法评估磷酸化EGFR的水平（Floc”H N et al.,2018）。
5.流式细胞术
流式细胞术主要用于检测细胞表面蛋白，然而，也可以分析细胞内蛋白，如磷酸化蛋白。只要目的蛋白磷酸化抗体、总蛋白抗体或细胞表面标志物蛋白分别带有不同的荧光标记（即利用不同标记的直标一抗分别去做免疫染色），流式细胞仪就可以利用激光来激发用于抗体检测的荧光染料并在不同通道捕获磷酸化相关信号和其他信号，比如目的蛋白总蛋白信号或细胞表面标志物蛋白的信号，即可在同一个细胞中同时评估一个或多个指标（包括磷酸化水平、总蛋白水平等）。流式细胞术采用荧光标记的单细胞悬液为检测样品，通过检测标记荧光的荧光强度来确定蛋白磷酸化的水平，因为偶联荧光素的磷酸化抗体（直标一抗）只与蛋白质的磷酸化形式结合，荧光的增加与磷酸化的水平呈正比。如果要评估同一个细胞中的多个蛋白时，必须精心选择滤光片组合和荧光染料，其光谱不能重叠。所以流式细胞术也可以同时在不同的细胞亚群中分析几种信号通路组成元件，大大提高工作效率。
除此之外，培养的细胞或组织切片原位也可以利用免疫荧光的方法进行磷酸化分析，进而评估蛋白磷酸化对蛋白定位、活性等方面的影响。比如ICC通常指利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测，而IHC是对完整组织切片中的蛋白进行检测。采用流式细胞术和ICC/IHC的方法检测蛋白磷酸化需要高亲和力、高特异性的抗体、阻断步骤、对照和抗体滴定，以及要求蛋白必须是稳定的，且抗体能够接近。所以，一般都需要新鲜取材并尽量减少处理过程对细胞或组织当中蛋白磷酸化的损害，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交联磷酸化蛋白，使其稳定，便于分析。固定后的细胞必须经过透化处理，让磷酸化特异抗体可进入细胞。
流式细胞术的特点：
流式细胞术可以实现快速、定量的单细胞分析；对于异质群体而言，通过细胞表面标志物表型分析可以检测特定细胞类型中的目的蛋白，而无需预先分离细胞；该方法适合于分析小的、稀少的细胞群，且不必担心在细胞分选过程中发生细胞的损失或蛋白表达的改变；但该方法需要特异性荧光染料，耗费高、仪器贵。
图5 流式细胞术检测Stat3磷酸化水平（Krutzik P O et al., 2005）。
参考文献
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