2018年，Branon等人使用酵母展示、定向进化、酪酰胺信号放大（TSA）、连接酶还原去除和负选择来生成了两种新的连接酶：TurboID和miniTurbo，能够在异源表达以及活体秀丽隐杆线虫和果蝇中进行明显更强的生物素标记（Branon et al., 2018）。其中，TurboID的分子量为35kDa，miniTurbo的分子量仅为28kDa，与野生型BirA相比，N端结构域缺失，并且有13bp的突变。
图3 BioID和TurboID的工作流程（Guo et al., 2023）。
由于传统的PL方法在靶向特异性方面存在局限性（无法获得特定的蛋白质复合物或定位细胞器接触位点），并且可能无法耐受高分子量蛋白质融合。为了解决这些问题，科学家们对标记酶进行了拆分，Split-APEX和split-BioID被较早推出，但split-APEX需要添加H2O2和亚铁血红素，限制了其在体内的使用，而split-BioID的活性非常低。2020年，Cho等人结合了TurboID的两个非活性片段，研发出了split-TurboID，其分子量为35kDa，这两个非活性片段可通过蛋白质-蛋白质相互作用或细胞器-细胞器相互作用重新组装。Split-TurboID有两种形式：低亲和力和高亲和力，生物素孵育时间小于1h后，两种形式均能催化PL，其活性不仅远高于split-BioID，且也高于全长BioID（Cho et al., 2020），其工作流程如图4所示。
2021年，Santos-Barriopedro等人开发了一种称为ProtA-TurboID的方法，该方法不需要额外的突变，酶是生物素连接酶TurboID和抗体识别分子ProteinA的重组融合体。原则上可以在3天内确定任何目标蛋白的近端蛋白质组。由于它不需要对靶细胞进行转染、转导或其他遗传操作，因此可应用于任何细胞类型。
（2）2020年，Kido等人重建了BirA算法，并利用宏基因组数据构建了一种新的邻近依赖性生物素标记酶，称为AirID，尽管其与BioID的序列相似性为82%，但AirID在体外和细胞实验中对相互作用蛋白表现出更高的生物素化活性。同样的，科学家又对AirID的基础上研发了splitAirID（Schaack et al., 2023）。
2012年，Martell等人从二聚豌豆或大豆抗坏血酸过氧化物酶中提取了一种新的邻近标记酶即APEX，与HRP相比，APEX缺乏二硫键和钙结合位点，分子量较小（约28 kD），并且作为单体发挥作用（Martell et al., 2012）。APEX及其工程衍生物的引入代表了该领域的重大进步，且基于APEX的标记比基于BirA的方法具有一些优势。
最初，开发的APEX是为了催化二氨基联苯胺依赖的H2O2聚合，用于生成高分辨率电子显微镜图像，然后进一步优化以实现邻近依赖的蛋白质生物素化。2015年，Lam等人对APEX进行了定向改进，研发出了APEX2（Lam et al., 2015）。目前，APEX和APEX2不仅用于蛋白质组学，还用于研究亚细胞区室的转录组，APEX2介导的RNA标记为绘制亚细胞转录组图谱提供了一种有前景的方法。
为了解决PL中的脱靶标记问题，2019年，Han等人开发了split-APE（sAPEX），分为两部分，AP和EX，AP是选自酵母展示文库的200个氨基酸的N端片段，EX是50个氨基酸的C端片段。每个片段本身没有活性，但是当在分子相互作用过程中重组时，过氧化物酶活性就会恢复（Han et al., 2019）。Split-APEX技术已应用于哺乳动物细胞膜、非编码RNA支架和线粒体相关内质网接触位点。
（2）2018年，Benhalevy等人使用APEX2介导的蛋白质特异性生物素化和紫外线（UV）交联开发了Proximity-CLIP，可研究细胞核、细胞质和细胞-细胞中的RNA和蛋白质，在RNA结合蛋白（RBP）研究中具有显著优势。
（3）2019年，Alejandro等人使用APEX2开发了APEX-seq，是用于探索RNA的PL技术。然而，该技术有两个缺点：需要在靶细胞中重组表达APEX-fusion；难以标记大分子复合物内的RNA。
（4）2020年，有学者提出将MS2-MCP系统或CRISPR/Cas13系统与APEX2结合，以针对特定的RNA，但这种方法仅在过度表达、高丰度的细胞RNA上得到证实。
（1）酶与目标蛋白融合并在活细胞中表达，且不破坏目标蛋白的定位、功能和相互作用；
（2）酶与信号肽融合并靶向特定的亚细胞区室；
（3）将酶底物添加到细胞后，酶与底物反应产生反应中间体，共价标记附近的核酸或蛋白质。其中，表1中总结了常见PL技术应用的工具酶，表2总结了PL的一般应用以及不同PL酶的优缺点。
表1 常见用于PL的工具酶（Mathew et al., 2022）。
表2 PL的一般应用以及不同PL酶的优缺点
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