邻近连接技术（Proximity Ligation Assay， PLA）是一种高灵敏度的分子检测方法，用于单个细胞水平上可视化的蛋白相互作用研究。该技术使用特异性的抗体来识别并结合目标蛋白，再通过带有一段寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针识别一抗并与之结合；当两个目标蛋白靠近时，两个目标蛋白的PLA探针的DNA就会配对互补，然后在连接酶的作用下，PLA探针上的DNA片段被连接在一起，会形成环状结构，通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。该方法依赖于亲和探针可对近距离（<40 nm）目标分子的进行识别，并将蛋白质检测转变为DNA核酸序列的检测来实现对特殊蛋白质的检测、定量及定位。与传统Co-IP验证蛋白互作技术相比，PLA技术可以观察互作蛋白发生的细胞区域；并且可以和病理技术相结合，观察在某些特定细胞内的蛋白互作情况，通过荧光强度来反映蛋白互作强弱情况，真正实现蛋白互作的可视化。
图1 PLA技术原理（Alam MS., 2018）。
经典的PLA实验流程如下：
（1）样本处理：用多聚甲醛固定处理好的细胞爬片；组织样本石蜡包埋、切片后进行脱蜡。
（2）封闭：将封闭液滴加到细胞爬片/组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。
（3）孵育一抗：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的细胞爬片/组织切片上，放入湿盒中，37°C孵育，使一抗与抗原充分结合。
（4）孵育PLA探针：再次清洗后加入PLUS和MINUS两种PLA探针。
（5）连接反应：滴加连接缓冲液（含连接酶），将载玻片置于预热的湿盒中，37°C下进行连接反应。
（6）扩增及成像：清洗掉连接缓冲液，加入扩增缓冲液（含聚合酶）并使用荧光显微镜观察两个目的蛋白之间的相互作用情况。
PLA技术在许多分子互作上有重要作用，下面由小医为大家讲解几篇案例，展示PLA实验结果及应用。
一、PLA在蛋白互作研究中的应用
PLA技术结合了抗体的特异性和PCR的灵敏度，能够高度敏感地检测蛋白相互作用。Alam MS运用PLA技术发现在Jurkat细胞中的ZAP-70和TCR zeta蛋白互作，互作主要发生在细胞质中。如图2所示，DAPI为细胞核的染料，用于细胞核的定位；胚芽凝集素（WGA）作为一种细胞膜染料，用于细胞膜的定位；红色的亮点代表ZAP-70和TCR zeta蛋白互作产生的荧光。可以明显的看到，红色的亮点主要分布在细胞质，即ZAP-70和TCR zeta蛋白互作主要发生在细胞质。
图2 PLA技术检测ZAP-70和TCR zeta蛋白的互作情况（Alam MS., 2018）。
二、PLA在组织样本中的应用
LRRK2激酶在帕金森疾病中有重要调控作用，LRRK2激酶活力依赖于pS1292蛋白，当pS1292蛋白磷酸化并与LRRK2激酶结合时，LRRK2激酶将会被激活。Matthew等人用PLA技术来观察LRRK2与pS1292蛋白在帕金森大鼠脑组织中多巴胺神经元上的互作情况。作者先用酪氨酸羟化酶（TH）的抗体标记多巴胺神经元，然后再加入LRRK2与pS1292蛋白一抗，接着进行PLA实验。如图3-A所示，TH（呈现蓝色）是标记多巴胺神经元，红色代表LRRK2与pS1292蛋白互作情况；当没有鱼藤酮（rotenone）治疗的大鼠，LRRK2激酶与pS1292蛋白几乎没有发生结合，当鱼藤酮（rotenone）治疗大鼠后，LRRK2激酶与pS1292蛋白在多巴胺神经元中出现显著互作情况。图3-B显示红色荧光强度代表两组处理中LRRK2激酶与pS1292蛋白互作强度，PLA不仅可以实现蛋白互作的定位，同时可以定量分析蛋白互作的强弱，这是传统蛋白互作技术Co-IP难以实现的。
图3 PLA技术检测LRRK2与pS1292在大鼠多巴胺神经元中的互作（Matthew et al., 2021）。
三、PLA在蛋白与RNA互作研究中的应用
PLA技术不仅可以应用于验证蛋白与蛋白的互作，也可以用于验证蛋白与RNA的互作。在固定细胞前，先合成biotin-RNA的探针，转染细胞；后续步骤和经典的PLA技术相同，加入抗生物素抗体和目标蛋白抗体，最后通过扩增反应及荧光显微镜观察蛋白与RNA互作情况。
图4 PLA技术验证蛋白和RNA互作的流程图（George et al., 2022）。
cMYC的mRNA有多个ARE结构域，George等人运用PLA技术来探究FXR1在cMYC的mRNA哪个区段结合。如图5所示，作者通过FXR1蛋白与不同cMYC的mRNA片段互作的结果，发现FXR1蛋白主要结合在cMYC的mRNA P1、P3、P4片段。蓝色为细胞核染色（DAPI染色），红色为FXR1蛋白与cMYC的mRNA互作，绿色为cMYC的mRNA的染色。图中可以看到cMYC的mRNA与FXR1蛋白互作主要发生在细胞质中。
图5 PLA技术检测FXR1蛋白与cMYC的mRNA互作情况（George et al., 2021）。
PLA技术还有其它方面的应用，在生物医学领域PLA技术还可用于微量样本微弱互作检测、单细胞蛋白互作与翻译后修饰、疾病标志物的发现、药物筛选等研究。综上所述，邻近连接技术（PLA）是一种高灵敏度、高特异性的蛋白互作检测技术，具有广泛的应用前景。随着技术的不断发展和完善，PLA技术将在更多领域发挥重要作用。
参考文献
Alam M S. Proximity ligation assay (PLA)[J]. Current protocols in immunology, 2018, 123(1): e58.
George J, Mittal S, Kadamberi I P, et al. Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines[J]. STAR protocols, 2022, 3(2): 101340.
George J, Li Y, Kadamberi I P, et al. RNA-binding protein FXR1 drives cMYC translation by recruiting eIF4F complex to the translation start site[J]. Cell reports, 2021, 37(5).
Keeney M T, Hoffman E K, Greenamyre J T, et al. Measurement of LRRK2 kinase activity by proximity ligation assay[J]. Bio-protocol, 2021, 11(17): e4140-e4140.
