你听说过「瓷娃娃、月亮的孩子、熊猫宝宝、蓝嘴唇」吗？这些美丽的名字隐藏着人们对罕见病患儿的关爱，因为他们分别对应成骨不全症、白化病、戈谢病以及肺动脉高压等少为人知的罕见病，这些罕见病为患儿的生活带来巨大的痛苦。他们有的人打个喷嚏就会骨折；有的人害怕阳光，基本只能在夜晚活动……到底什么是罕见病？临床上如何对罕见病进行研究？本期，让我们一起了解罕见病以及临床上对于罕见病的一些研究思路。

图 渐冻症患者：斯蒂芬·威廉·霍金什么是罕见病

根据《中国罕见病定义研究报告2021》，将新生儿发病率小于1/10000、患病率小于1/10000、患病人数小于14万人的疾病定义为罕见病，因其发病率极低，患病人数较少，通常又被称为“孤儿病”。据统计，全球已知的大约有7000-8000种罕见病，患病总人数超过3.5亿，其中中国罕见病人数已达到2000万人，并且以每年20万人的数量增长。我国分别在2018年和2023年公布了第一批和第二批《罕见病名录》，共涉及207种罕见病，为这些罕见病的诊断和治疗提供了参考依据。

图1 罕见病相关数据（上海四叶草罕见病家庭关爱中心）罕见病的发病原因

罕见病病因复杂多样，目前已知的罕见病中，仅有3000多种已经明确发病原因。其中基因突变导致的罕见病占比达到80%，是罕见病的主要病因之一。例如，白化病是由于黑色素形成及转运相关的基因如MATP（SLC45A2）、SCL24A5、GPR143等突变导致；精氨酸酶缺乏症是由于ARG1基因突变导致精氨酸酶I表达异常，无法将精氨酸水解而发病。除此之外，遗传缺陷和环境因素以及多因素共同作用也会导致罕见病的发生。例如进行性肌营养不良是典型的遗传性疾病，包括X连锁隐性遗传、常染色体显性遗传以及常染色体隐性遗传等。肌萎缩侧索硬化（ALS）则通常认为是由基因（SOD1和TDP-43）突变与环境因素共同作用的结果。罕见病的诊断方法

罕见病因其发病率低，病例少，导致临床上难以积累足够的诊疗经验。数据显示，我国罕见病的平均诊断时间为5年，虽然我国《罕见病诊疗指南》已为207种罕见病的诊断提供了依据，全球仍有60%的罕见病完全缺乏确切的诊断依据。目前对于罕见病诊断分析主要通过家系分析、临床表现、组织病理以及基因诊断四个方面进行，由于接近80%的罕见病都是由于基因突变导致，因此基因诊断成为罕见病诊断的重要手段。例如Alport综合征是一种遗传性胶原病，是由于编码IV型胶原蛋白α-3链、α-4链和α-5链的基因COL4A3、COL4A4、COLA5突变导致的基底膜病变，因此通过基因诊断COL4A3-5是否出现基因突变成为临床诊断Alport综合征的金标准。基因诊断主要包括针对特定区域进行测序的Targeted Sequencing（Panels）、针对全部外显子进行测序的Whole Exome Sequencing （WES）以及针对整个基因组进行测序的Whole genome Sequencing （WGS）。由于内含子突变通常会导致RNA出现异常剪接，进而影响基因功能；WGS覆盖面最为广泛，可以对基因的所有序列进行测序，因此WGS是临床上进行罕见病基因诊断的常用方法。

图2 基因诊断检测技术罕见病临床研究思路

由于罕见病大多是由基因突变导致，每个人平均携带3个致病基因突变，若父母携带相同的基因突变，便可能导致新生儿出现罕见病，因此全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）成为罕见病防治的重要辅助手段。在临床上，通常在对患者的病理表型进行分析后，收集疑似患有罕见病的患者及其父母的血液样本提取DNA并进行WGS测序，分析候选致病基因是否出现突变；随后，利用生信预测网站对突变位点保守性、有害性进行预测分析，最后通过相关的体外实验进行突变功能验证，最终明确突变是否致病，为以后的疾病诊断和治疗提供理论支持。

图 3 临床研究思路参考文献案例

Alport综合征是由于基因突变导致的基底膜病变，通常表现为血尿、蛋白尿、肾功能下降、听力损失和眼睛异常，COL4A3-A5基因诊断是该病诊断的金标准。研究人员收治了一名肾功能不全患儿，家系分析发现该患儿家族成员具有肾脏疾病家族史；病理检测结果显示该患儿表现为血尿和蛋白尿，肾活检结果显示患儿及其母亲和哥哥均出现肾小球基底膜不规则增厚和变薄（图4）。

图4 肾功能不全患儿肾活检病理检测结果（Chen et al.，2024）

研究人员高度怀疑该患儿家族成员患有Alport综合征，随后研究人员通过WGS对家族成员的COL4A5基因突变进行检测，结果显示，该家族部分成员携带COL4A5基因的新的c.4298-8G＞A杂合突变（图5）。

图5 家族成员家系图和基因测序结果（Chen et al.，2024）

为探索该突变是否影响基因功能，研究人员首先利用网站预测发现该突变可能导致COL4A5的RNA剪接发生异常，利用minigene实验进行验证发现，该突变导致46号内含子右侧保留6bp的碱基，使COL4A5蛋白出现p.Pro1432_Gly1433insGluIle变异（图6）。

图6 minigene实验结果（Chen et al.，2024）

最后，作者通过分析COL4A5蛋白出现p.Pro1432_Gly1433insGluIle变异附近氨基酸保守性，预测突变可能对氨基酸结构的影响，结果显示，p.P1432附近氨基酸高度保守，蛋白质3D结构模型显示p.P1432_G1433insEI氨基酸变异导致蛋白表面静电势由正电转变为负电，可能影响蛋白结构（图7）。

图 7 氨基酸保守性预测和3D蛋白结构分析结果（Chen et al.，2024）

最终，研究人员通过家系分析、临床表现、病理表型以及基因诊断四个方面，确定该患儿及部分家族成员患有Alport综合征。Minigene实验流程

针对本研究所用的minigene实验，这里为大家介绍一下简单实验流程，关于minigene更加详细的实验原理和实验流程可参考我们前期公众号文章：《一文解析Minigene技术原理及应用》以及《Minigene实验——RNA剪接事件检测利器》。

图 8 minigene实验流程总结

罕见病并不罕见，每个人都携带3-5个致病基因突变，目前基因检测技术已经成为产前疾病预防以及临床疾病诊断重要的手段。利用minigene实验检验临床上发现的致病基因新突变是否会导致疾病的发生已经成为一种方便快捷的前期验证手段，为罕见病的诊疗提供良好的技术支持。

伯远医学拥有一流的技术团队、丰富的项目经验，提供专业minigene实验技术服务。客户只需提供基因信息和变异位点信息，伯远医学即可为您提供项目方案，进行minigene实验验证，解读基因变异结果。欢迎大家前来咨询minigene实验。

参考文献

Chen SY, Xu GB, Zhao ZX et al. A novel COL4A5 splicing mutation causes alport syndrome in a Chinese family [J]. BMC Medical Genomics, 2024, 17(1): 108.