一、Minigene技术背景
基因变异与人类疾病的发生密切相关，其中变异影响基因pre-mRNA的剪接是变异致病的一种重要机制。研究表明，大约15%-30%的致病变异会导致pre-mRNA发生异常剪接事件（Padgett RA, 2012）。在RNA剪接过程中，mRNA前体内含子两端边界通常存在共同序列（5’-GU—–GA-3’）作为剪接识别信号，其中5′-GU为剪接供体信号，3′-AG为剪接受体信号，这种识别5′-GU—GA-3’序列的剪接模式被称为GU-AG法则或Chambon法则。若DNA在剪接识别信号处或附近发生碱基变异，则通常会导致异常剪接事件的发生。
常见的pre-mRNA异常剪接事件类型包括外显子跳跃、外显子互斥、供/受体位点改变以及内含子保留等（图1），这些异常剪接事件通常导致剪接后的mRNA出现碱基插入或缺失形成移码变异，产生氨基酸插入、缺失或者翻译提前终止，影响基因功能，最终导致疾病的发生。
伴随基因测序技术的发展，基因检测已经成为疾病诊断的重要辅助手段。虽然测序可以检出大量潜在致病变异，但由于临床样本难以收集，或者基因表达量低等原因，导致对致病变异是否影响pre-mRNA剪接的验证存在着极大地限制。而Minigene技术的出现则能够很好的解决这一问题，minigene实验结果对于变异是否影响RNA剪接过程的提示作用几乎达到100%（Cooper TA, 2005）。
二、Minigene实验技术原理
Minigene实验主要原理是通过将变异位点附近的外显子和内含子插入到minigene载体MCS区域构建报告质粒（图2），该报告质粒除常规启动子和终止子元件外，还包含剪接供体、剪接信号GT-AG、剪接受体等元件，能够模拟pre-mRNA剪接环境，实现在体外对异常剪接事件进行验证。
三、Minigene实验技术流程
（1）根据基因变异位点构建WT和MUT报告质粒；
（2）将质粒转染细胞，培养24-48 h；
（3）提取RNA并反转录为cDNA；
（4）利用引物对以cDNA为模板进行PCR扩增；
（5）通过DNA电泳检测产物条带大小；
（6）通过测序分析PCR产物序列信息；
（7）判断是否存在mRNA异常剪接事件以及明确异常剪接结果（图3）。
四、经典文献案例
通常将影响RNA剪接的变异分为经典剪接变异和非经典剪接变异。经典剪接变异是发生在GU-AG区域的变异，非经典变异则通常指UTR区变异、外显子内部非剪接区变异、外显子同义突变以及外显子错义突变等，这些发生在不同区域的变异都可能导致RNA出现异常剪接，并通过minigene实验进行验证。
1、经典剪接变异（GU-AG变异）
Wang等人通过WES在发现家族局灶性癫痫伴可变病灶家系患者中发现基因DEPDC5的新型变异c.1217 + 2T > A，minigene实验证实c.1217 + 2T > A变异使CEPDC5基因出现Intron 17内含子保留（图4），形成截短蛋白，导致疾病的发生（Wang et al., 2004）。
2、非经典剪接变异
非经典剪接变异通常包括UTR区域变异、内含子变异、外显子非剪接区变异、外显子同义突变以及外显子错义突变等。
（1）UTR区序列变异
Babu等人在Léri-Weill骨质化症患者（LWD）中通过基因检测发现 5个SHOX基因5’-UTR 区变异（c.-58G > T、c.-55C > T、c.-51G > A、c.-19G > A和c.-9del），minigene实验证实c.-19G > A 变异导致SHOX基因Exon 2部分缺失，使SHOX基因产生新的剪接变体（Babu et al., 2021）。
（2）内含子序列变异
Shu等人在先天性粒细胞缺乏症患者中通过WES发现ELANE基因携带 c.598 + 79G > T变异，minigene实验证实该变异导致Intron4部分保留，ELANE基因Exon4和Exon5中插入83bp序列，产生截短蛋白p.Gly200ValfsTer40，最终导致疾病的发生（Shu et al.，2024）。
（3）外显子非剪接区变异
Li等人在马凡综合征患者中鉴定发现FBN1基因携带c.4773A > G变异，minigene实验证实c.4773A > G变异导致FBN1基因出现Exon 39外显子跳跃事件，FBN1蛋白缺失23 aa，导致患者出现马凡综合征（Li et al., 2020）。
（4）外显子错义变异
Ito等人在对常染色体显性遗传致病基因LMNA的变异进行分析发现，LMNA: c.768G > A 变异使得外显子4部分缺失， LMNA蛋白重要结构域丢失15 aa，导致疾病的发生（Ito et al., 2024）。
（5）外显子同义变异
Zhang等人在一名疑似胃肠道缺陷和免疫缺陷综合征2（GIDID2）新生儿中检测鉴定发现患儿携带PI4KA基因c.5846T > C（p.Leu1949Pro）和c.3453C > T（p.Gly1151=）变异，minigene实验证实c.3453C > T（p.Gly1151=）变异使得PI4KA基因Exon 30缺失碱基GTGAG，产生截短蛋白（p.Gly1151GlyfsTer17），最终导致疾病的发生（Zhang et al.，2022）。
五、总结
基因检测已经成为临床疾病诊断重要的辅助工具。对于临床基因检测发现的新的基因变异来说，minigene实验已经成为一种方便快捷的验证变异是否影响pre-mRNA剪接的手段，对于基因变异功能阐释和致病性分析提供了一定的实验依据。因此，minigene实验毫无疑问已经成为RNA异常剪接事件的研究利器。
六、伯远医学minigene实验技术服务
伯远医学提供一站式minigene实验技术服务，客户只需提供基因信息和变异位点信息，伯远医学即可为您提供项目方案，进行minigene实验验证，解读基因变异结果。
（1）技术优势
①我司根据变异位点信息，利用生信网站进行分析，预测发生剪接事件的可能性以及类型，并根据预测结果选择合适的外显子和内含子区域，优化项目方案。
②我司使用经典minigene报告载体pSPL3-mini，检测引物为载体自带引物对，避免因细胞本底剪接事件干扰实验结果。
③我司使用的pSPL3-mini载体最少允许仅插入一个外显子或内含子，极大缩短载体构建所需序列长度，降低实验成本；
（2）技术服务流程
（3）实验交付内容
①测序正确的报告质粒（包括质粒图谱信息和注释信息）；
②详细的结题报告（包含实验步骤和实验结果）；
③原始实验数据（包括DNA电泳图和PCR测序文件）；
伯远医学拥有一流的技术团队、丰富的项目经验，提供专业minigene实验技术服务，适用于RNA剪接事件研究，欢迎大家前来咨询minigene实验。
参考文献
Padgett RA. New connections between splicing and human disease[J]. Trends Genet, 2012, 28(4): 147-154.
Cooper TA. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements[J]. Methods, 2005, 37(4): 331-340.
Wang YC, Niu WB, Shi H, et al. A novel variation in DEPDC5 causing familial focal epilepsy with variable foci[J]. Front Genet, 2024, 21(15): eCollection.
Babu D, Vannelli S, Fanelli A, et al. Variants in the 5’UTR reduce SHOX expression and contribute to SHOX haploinsufficiency[J]. Eur J Hum Genet, 2021, 29(1): 110-121
Shu Z, Deng MY, Han TX, et al. De Novo Deep Intron ELANE Mutation Resulting in Severe Congenital Neutropenia[J]. J Clin Immunol, 2024, 44(8):183.
Li MJ, Lu XX, Dong J, et al. A synonymous mutation in exon 39 of FBN1 causes exon skipping leading to Marfan syndrome[J]. Genomics, 2020, 112(6): 3856-3861.
Ito K, Patel PN, Gorham JM, et al. Identification of pathogenic gene mutations in LMNA and MYBPC3 that alter RNA splicing[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2024, 114(29): 7689-7694.
Zhang KH, Kang LL, Zhang HZ, et al. A synonymous mutation in PI4KA impacts the transcription and translation process of gene expression[J]. Front Immunol, 2022, 19(13): eCollection.
