可变剪接（Alternative Splicing）是基因表达调控的一个关键过程，在这一过程中，一个基因的不同剪接形式可以产生多种不同的蛋白质变体。这种机制极大地增加了蛋白质的多样性，使得一个基因能够参与多种细胞功能和生理过程。许多疾病包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和免疫系统疾病，都与异常的可变剪接模式相关联。特定的剪接变体可以作为某些疾病的生物标志物，用于早期诊断或疾病进展的监测。可变剪接为药物开发提供了新靶点，通过设计药物来调节异常的剪接过程，可以恢复正常的蛋白质功能，从而治疗疾病。因此，研究Pre-mRNA可变剪接具有重要意义。
01真核生物Pre-mRNA剪接过程
真核生物的基因通常是由多个外显子（编码区）和内含子（非编码区）交替组成。剪接过程是由一种高分子量的剪接体介导完成的。剪接体是由U1、U2、U4、U5和U6五种小核糖核酸蛋白（Small nuclear ribonucleoprotein, snRNPs）和多种非snRNP蛋白质组成的一种复合体。snRNPs和其他复合体蛋白质相互作用，形成功能复杂的结构，确保剪接体能够正确地定位和识别剪接位点，完成剪接过程。
Pre-mRNA剪接的过程如下：
（1）U1 snRNP的识别：U1 snRNP与Pre-mRNA的5’端外显子结合，并以ATP依赖性方式识别5’剪接位点。在这一过程中丝氨酸/精氨酸富集蛋白（Serine/Arginine-rich proteins, SR蛋白）与异质核核糖核蛋白（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs）相互作用，SR蛋白识别并结合在外显子剪接增强子（Exonic splicing enhancer, ESE）上促进U1 snRNP识别5’剪接位点，而hnRNPs识别并结合在外显子剪接沉默子（Exonic splicing silencer, ESS）上阻碍U1 snRNP识别5’剪接位点。
（2）U2 snRNP的结合：U2 snRNP结合到内含子的分支位点形成剪接体前体。这是剪接的关键步骤，导致内含子的分离。
（3）U4/U5/U6 snRNP的组装：U4/U5/U6 snRNP与剪接体前体复合物相互作用组装成完整的剪接体。
（4）剪接体的催化活化：剪接体的催化活化通过两步酯交换反应完成。U2 snRNP招募十九号复合物（Nineteen Complex, NTC）和十九号复合物相关蛋白（Nineteen-Related Complex, NTR），进而释放U1和U4，然后打破剪接位点处的磷酸二酯键，产生两个相邻的外显子以及一个套索结构的内含子。
（5）剪接体的解除和剪接完成：内含子和snRNPs从剪接体复合物中释放出来，5’方向上的外显子攻击套索结构，去除内含子，并将相邻外显子连接起来完成剪接，最终生成成熟的mRNA。
另外，lncRNA可通过与剪接体相互作用从而影响Pre-mRNA剪接，具体机制介绍详见“非编码RNA与可变剪接的相互作用”。
02minigene实验原理及流程
minigene实验是一种用于研究基因Pre-mRNA剪接变异机制的重要工具。这种实验方法是构建一个包含基因特定区域的小型基因（minigene），通常包括外显子、内含子和必要的剪接信号，然后将其插入到一个载体中，并转入细胞中进行表达。通过构建不同的minigene剪接变异体，研究者可以探究特定序列如何影响剪接过程，包括剪接信号的识别、剪接复合物的组装等。minigene的主要实验流程如下：
（1）根据基因的突变位点，生信分析可能引起的发生剪接变化；
（2）在突变位点区域序列（含有连续的几个外显子和内含子）构建minigene-mut质粒和minigene-WT质粒；
（2）minigene载体转染细胞；
（3）RT-PCR检测或测序分析剪接变化情况。
03minigene案例分享
BRCA1基因位点突变导致Pre-mRNA剪接改变，会增加乳腺癌和卵巢癌的得病风险，BRCA1基因的剪接变体也是许多癌症的生物标志物。因此对于BRCA1基因剪接变异研究和筛查十分重要。Steffensen等人用BRCA1基因序列构建了野生型minigene-WT质粒以及13种突变型minigene-mut质粒，13种突变位点为：c.80+1G>A，c.132C>T,c.213-1G>A，c.670+1delG，c.670+16G>A，c.4185+1G>A，c.5075-1G>C，c.-19-22_19-21dupAT，c.302-15C>G，c.547+14delG，c.4676-20A>G，c.4987-21G>T，c.5278-14C>G。野生型WT质粒和突变型mut质粒分别转染COS-7细胞，然后进行RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳分析条带。可以看到c.80+1G>A，c.132C>T,c.213-1G>A，c.670+1delG，c.670+16G>A，c.4185+1G>A，c.5075-1G>C，c.4676-20A>G产生了Pre-mRNA剪接的改变（可见凝胶电泳图），而突变型c.-19-22_19-21dupAT，c.302-15C>G，c.547+14delG，c.4987-21G>T，c.5278-14C>G未发生Pre-mRNA剪接变化。
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参考文献
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