载体，作为基因工程中的关键要素，承担着将目标基因有效输送至生物细胞内部的重要任务。在分子生物学与基因工程领域，载体被广泛应用，其核心功能在于携带外源基因或DNA片段，并成功引导其进入宿主细胞内部，进而实现自我复制。这些载体形式多样，包括但不限于质粒、噬菌体及病毒等，它们在基因转移、克隆及表达等过程中发挥着不可替代的作用。

一、质粒的概念及分类

质粒载体是人工构建，用于基因工程操作的一类载体，简称质粒。它是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，常见于原核细菌和真菌，绝大多数的质粒是小型环状DNA分子，少部分为RNA。

理想的质粒应具备以下特性：

1.强大的复制能力，确保其在细胞内能够自主复制并大量繁殖，从而有效实现目的基因的扩增；

2.高效的表达能力，作为表达载体，应充分利用宿主细胞的酶系统，实现目的基因的有效表达；

3.高度的稳定性，确保质粒在细胞内能够持续稳定地复制和表达；

4.适宜的酶切位点，即应含有合适的限制性核酸内切酶识别和切割位点，以便于外源基因的插入；

5.明确的遗传标记，以便于对重组体进行筛选和鉴定；

6.较小的分子量，以便能够容纳较大的外源基因，提升质粒的实用性和应用范围。

质粒载体根据进入受体细胞的不同，可分为原核载体、真核载体和穿梭载体。

1.原核载体：即能在原核细胞中复制和表达的载体。

2.真核载体：即能在真核细胞中复制和表达的载体。

3.穿梭载体：兼具原核载体和真核载体的双重特性，同时包含原核复制起点和真核复制起点，既能在原核生物中高效复制和表达，又能在真核生物中稳定遗传并调控基因表达。

质粒载体根据其功能与应用的不同，可大致划分为以下四类：

1.克隆载体：此类载体具备携带外源基因的能力，可在宿主细胞内进行复制扩增。主要用于克隆和扩增DNA片段（基因），但不包含启动转录、翻译等功能的元件。如pUC57载体。

2.表达载体：除包含克隆载体的基本构成元素（如ori、Ampr、MCS等）外，还具备转录和翻译所必需的DNA序列，即插入的目标基因。如pcDNA3.1(+)和pEGFP-N1载体。

3.干扰基因表达载体：该载体主要用于干扰特定内源性基因的表达，其上含有针对目标基因mRNA的shRNA，从而发挥沉默基因表达的作用。如pSilencer-U6-Puro载体。

4.病毒载体：此类载体基于病毒基因组改造而成，通过去除其致病性并保留其感染性等特性，可进一步包装成病毒颗粒。这为功能基因进入靶细胞或整合至基因组提供了极为便利的手段。如pLVX-CMV-MCS-Linker-EGFP-IRES-Puro载体。

二、质粒的基本元件要素

1.复制起点（Origin of replication，ori）

质粒复制起点是质粒DNA分子上启动复制的特定区域，负责精准调控复制的起始，对于质粒的稳定复制至关重要。它包含能被复制酶识别的特定序列，确保质粒在宿主细胞内的稳定高效复制，实现目的基因的高效表达。原核生物DNA分子中，仅存在一个复制起始位点，而真核生物DNA分子则具备多个复制起始位点。若质粒图谱中仅展示一个ori，则表示该质粒为原核克隆及表达质粒，适用于原核生物的复制过程。而若图谱上呈现两个ori，则表明该质粒具备穿梭质粒的特性，既能在原核生物中复制，也能在真核生物中复制。

2.启动子（Promoter，P）

启动子驱动目的基因的转录，是决定基因表达水平的关键因素。启动子有强弱之分，选择合适的启动子可以确保目的基因的高效表达。常见的强启动子有CMV、EF1a等，中等强度启动子有SV40、mPGK、hPGK等，弱启动子有UBC等。

3.增强子（Enhancer）

增强目的基因转录。

4.筛选标记（Selectable markers）

多为抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆，主要分为原核筛选标记和真核筛选标记。在原核细胞的筛选过程中，常用的标记物质包括氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cam）、卡那霉素（Kan）以及四环素（Tet）等。而对于真核细胞的筛选，则常采用嘌呤霉素（Puro）、新霉素（neo/G418）、潮霉素（Hyg）等作为标记。

5.多克隆位点（Multiple cloning sites，MCS

多克隆位点（MCS）是DNA载体上的人工合成序列，MCS通常位于启动子的下游，包含多个限制内切酶识别位点，用于插入外源DNA片段。

6.转录终止信号（polyA signal）

提示转录终止，起到稳定mRNA的作用。

7.荧光基因

通过独立表达或与目的基因融合表达的方式被设计在质粒上，可用于验证质粒转入细胞及目的基因表达、示踪、阳性检测和成像的作用，如GFP、EGFP、mCherry等。

8.蛋白标签

蛋白标签通常为较短的短肽，一般通过融合表达的方式连接在目的基因的3’或5’端，常见的标签包括Flag、Myc、GST、HA和His等。

三、质粒图谱解读

第一步：看ori鉴别质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）

原核生物只有一个复制起始点，而真核生物有多个复制起始位点。若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒，若质粒图谱上有两个及两个以上的ori，则表示该质粒是穿梭质粒。还有一种f1 ori，代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA，可以用来测序。

第二步：看质粒元件箭头方向

质粒图谱上都会存在箭头，启动子（白色箭头）的箭头方向代表转录方向，ori（黄色箭头）的箭头方向代表复制方向。设计引物及插入目的基因的方向是根据转录方向（启动子方向）来定的。由于质粒是环状双链DNA，所以质粒图谱上有的箭头顺时针，有的箭头逆时针，指的是DNA的两条链，它的启动子在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。一般情况下，顺时针代表阅读外圈（上链），逆时针代表阅读内圈（下链）。

第三步：看启动子确定质粒的作用

比如CMV、SV40和EF1a启动子常用于构建过表达载体；U6启动子常用于构建shRNA和sgRNA载体，lac启动子则是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子。

第四步：看筛选标记/抗性基因

质粒图谱中用抗生素缩写+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。AmpR常用于原核细胞，特别是大肠杆菌的筛选过程，PuroR则专门针对真核细胞，特别是肿瘤细胞的筛选工作。当大肠杆菌和肿瘤细胞中不存在含有这两种抗性的质粒时，就无法表达出抗性基因，所以只有质粒成功进入的细胞才能在抗生素的筛选下存活下来，因此可应用氨苄西林或嘌呤霉素筛选出阳性克隆。

第五步：看多克隆位点MCS

质粒图谱中圆圈外围的黑体字母代表酶切位点，可用于插入外源基因。不同载体所包含的限制性内切酶位点数量和组成因会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单一的酶切位点。顺序一般都是按照5’-3’的顺序排列的。有些酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。还有的酶切位点，在序列中只有一个，但也标注了一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。

第六步：看外源DNA插入片段大小

质粒通常仅能承载小于10 Kb的外源DNA片段。一般而言，外源DNA片段的长度越长，其插入的难度越大，稳定性也会相应降低，同时转化效率也会受到显著影响。

第七步：看载体是否含有表达系统元件

即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，并以此来区分克隆载体和表达载体。当克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。

第八步：看荧光标记、蛋白标签及其他

带有荧光标记的质粒，可直观判断质粒是否转染成功。根据蛋白特性选择不同蛋白标签有助于促进蛋白表达。蛋白纯化标签蛋白：His-Tag，GST-Tag等；蛋白检测标签蛋白：Flag-Tag，Myc-Tag，HA-Tag等；荧光蛋白表达标签：GFP，mCherry等。

小医叨叨

看到这里，相信大家已经对质粒图谱的解读有了清楚的了解，接下来那就找几张质粒图谱自行练习吧。可以在addgene网站（https://www.addgene.org/）搜索想要的质粒，并通过SnapGene打开。有需要SnapGene软件的，可以联系小医呦！

附我司常用载体图谱