蛋白-蛋白之间的相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）是细胞内调控的重要机制，介导了许多的生物学过程，在细胞的催化、转运、信号传导等许多生命过程和疾病的发生发展中起着重要作用。鉴定蛋白-蛋白之间的相互作用是后基因组时代的重要研究内容。一般来说，质谱技术是不能直接研究蛋白互作的，需要和其他技术联用，最常见的就是免疫共沉淀（Co-IP）和Pull down。采用质谱技术既可以验证已知蛋白相互作用，也可以鉴定与目的蛋白发生互作的未知蛋白。它不仅告诉我们样品中存在哪些蛋白，还可以比较不同样本中蛋白的相对丰度，寻找差异蛋白。

目前来讲，针对想要研究的目的蛋白，深入解析其PPIs或PTMs（Post-Translational Modifications，翻译后修饰）的分子机制，是显著提高学术文章研究水准的重要内容。而IP-MS（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry）就是目前发现和揭示PPIs/PTMs的主流技术方案。

一、IP-MS的原理

IP-MS即免疫沉淀-质谱联用技术，是一种基于质谱技术的分析方法，通过用特定抗体捕获目的蛋白，然后用质谱仪对免疫沉淀后的复合物进行高通量分析，从而获得蛋白质的定量和定性信息。

其原理是通过亲和纯化的方法，利用特异性抗体富集细胞内的靶蛋白，通过加入能够与抗体结合的protein-A/G（预先结合固化在琼脂糖球或磁珠上），形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein-A/G小珠”复合物，将复合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以分离蛋白，然后进行液相色谱-质谱联用，对酶解后的肽段进行质谱分析，从而分析与目的蛋白相互作用的未知蛋白。

二、IP-MS的实验流程

IP-MS实验的完整流程通常包括以下几个部分：

（1）材料获取：细胞或组织。

（2）蛋白提取：可根据目的蛋白的特性加入不同类型的IP裂解液及抑制剂。如：非磷酸化蛋白可不添加磷酸酶抑制剂；IP背景高，选用裂解度高的裂解液；目的蛋白IP不下来，选用裂解度低的裂解液等。

（3）Beads结合抗体孵育：对应的抗体与Beads结合，注意须用IP抗体及实验所需的Beads载量。

（4）抗体结合诱饵蛋白：诱饵蛋白与抗体结合后被固定于Beads上。

（5）洗脱：把诱饵蛋白从beads上洗脱下来。

（6）Western Blot：评估诱饵蛋白富集程度，是否能够进行质谱检测。

（7）酶解：还原-打开二硫键，烷基化-封闭巯基，胰酶酶解-打开精氨酸/赖氨酸C端肽键，脱盐-去除肽段样品盐离子。

（8）质谱检测：LC-MS/MS检测样品，采集图谱，获得质谱原始数据。

（9）质谱数据库检索：分析质谱原始数据，匹配蛋白数据库，获得定性及定量信息。

（10）质谱质量评估：评估肽段长度，肽段数目，漏切位点等。

（11）质谱数据分析：包括定量数据统计，定量数据相关性，差异蛋白筛选，PCA分析，聚类分析，GO和KEGG分析等。

三、IP-MS送样要求

1.未做IP实验，建议送细胞沉淀进行IP-MS检测。

①细胞量不少于2×10⁷（约两个10 cm培养皿，总蛋白量5mg左右）。一般来说，细胞量越多，IP-MS实验效果越理想。

②其他样品：如组织、细菌和蛋白溶液等可根据蛋白含量进行换算。

2.做完IP实验后，建议送Beads进行MS检测。

①Beads用PBS缓冲液清洗干净，以Beads沉淀形式保存和送样。

②其他样品：如SDS-PAGE胶块或胶条，要求目标条带清晰可见，考染后的胶条一定要脱色完全。

四、IP-MS相关问题答疑

1.IP-MS对照组设计及意义？

①对照组，一般是转染空载的细胞或者IP抗体同种属空白的IgG抗体。

②IP实验对照组的设置需要遵循控制变量原则，即除了改变一个条件使对照组无法亲和纯化诱饵蛋白以外，其他所有实验条件、试剂种类及用量需与实验组保持一致。

③设置对照组的意义是为了排除非特异性蛋白的结合。

2.IP-MS数据如何解读及候选蛋白如何选择？

①根据蛋白定量差异倍数（Fold change，一般>1.5）和P值（P<0.05）进行排序筛选，由高到低排列。

②根据GO和KEGG富集分析，选择与诱饵蛋白相同或相关生物学功能或信号通路的互作蛋白。

③根据互作网络分析（如STRING数据库），选择互作网络中连接度较高的核心蛋白。

④根据文献报道选择明星通路中的蛋白。

⑤根据文献报道并结合诱饵蛋白功能或课题方向选择可能互作的蛋白。

3.IP-MS筛选出的互作蛋白，如何进行验证？

①一般推荐Co-IP实验进行验证，分别以诱饵蛋白和候选互作蛋白，进行Co-IP双向互拉，通过WB检测证实二者是否存在相互作用。

②其他：如通过蛋白结构预测和分子对接，预测诱饵蛋白和候选互作蛋白的相互作用及互作位点，侧面验证蛋白相互作用，并可为后续功能实验提供线索。

4.质谱什么时候做定量什么时候不定量？

根据自己的实验需要来选择，如果要知道两者之间的差异蛋白（如用质谱比较空白对照与目的蛋白过表达之间的差异蛋白来鉴定与目的蛋白相互作用），就需要定量，如果只是想知道所提供的材料里面的蛋白种类就不需要定量。

5.IP-MS实验对抗体有什么要求？

若是内源蛋白抗体，抗体需要达到IP级别，并且需要测试其效价，商品化的标签抗体也需要达到IP级别。

6.IP实验背景高可能是什么原因，应怎样避免？

①蛋白降解，为防止蛋白降解，样品裂解时须在冰上操作，同时加入蛋白酶抑制剂（如PMSF）。

②样品中有不溶解的蛋白残留，建议离心，立即取出上清。

③IP抗体用量过多，导致了非特异结合，建议减少抗体使用量。

④抗体特异性不好，建议换用亲和纯化，特异性好的抗体。

⑤洗涤不充分，建议通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂优化洗涤缓冲液。

参考文献

Dragana L ,L. K K ,C.-H. H L, et al. An optimized co-immunoprecipitation protocol for the analysis of endogenous protein-protein interactions in cell lines using mass spectrometry[J].STAR Protocols,2022,3(1):101234-101234.