RNA作为一个多功能分子，在细胞内展现出惊人的多样性。首先，在转录过程中，mRNA承担着遗传信息搬运工作，其可将DNA中的编码信息转录为可被细胞识别的语言，为基因表达提供精准的模板。这种信息传递的功能，也促使RNA成为生命的基石，保障着遗传信息的传承。其次，RNA还在蛋白质合成中扮演关键角色，例如，mRNA可通过RNA运输，将蛋白质合成的指令从细胞核传递到细胞质，随后通过翻译过程将其翻译成具体的蛋白质结构。这个过程不仅是维持细胞结构和功能的必需步骤，也是细胞内生命活动的核心。
由此可见，RNA定位在上述这些功能中显得尤为重要。这是因为，通过将转录本引导至特定亚细胞区室，RNA的空间定位不仅提高了信息传递的精确性，也使得蛋白质合成更加高效。这种高度精细的调控，使得细胞能够在不同的环境和发育阶段中做出精确的响应，增强了生物体的适应性；不仅如此，RNA的定位还进一步参与了基因调控，其中，非编码RNA和其他调控RNA，通过RNA定位，可以精确地影响基因表达，调整细胞内的生物过程。一些小RNA（如miRNA和siRNA）则在特定位置调控着细胞的命运，影响其生命周期、分化和凋亡等关键过程。
总体来说，RNA的功能与其定位相辅相成，共同构建了一个细致而复杂的细胞内网络。在这个网络中，RNA不仅是信息的搬运者和蛋白质合成的导航者，更是生命活动的精密调控者。其定位的重要性，为我们揭示了细胞内生命奥秘的精致机制，拓展了我们对细胞内功能的理解。
下面，小医就将介绍几种RNA示踪的方法，我们一起来学习下吧！
原位杂交
原位杂交即通过使用标记有荧光染料或地高辛的核酸探针，直接在细胞或组织中观察特定DNA或RNA序列的存在和位置，可用于研究基因表达、基因组结构和细胞功能。该技术包括探针设计、样本制备、杂交、洗涤和检测等步骤，包括荧光原位杂交（FISH）和放射性原位杂交（ISH）两种类型。其优势为直观性、空间分辨率高和多样性应用，但原位杂交存在着信号噪音和对复杂样本处理的挑战，同时难以观测活体中RNA的动态变化。
RNA结合蛋白偶联荧光蛋白
目前，常用的观测活体细胞中RNA动态变化的思路为利用带有工程化基团的RNA可以与荧光蛋白和特定RNA结合蛋白的融合体相结合；例如，MCP-MS2系统、PCP、λN或Cas系统。在这些方法中，未结合的荧光蛋白融合物自由扩散，存在显著的背景荧光，每个RNA需要多达48个绿色荧光蛋白（GFP）融合物才能获得最佳的信噪比。目前尚不清楚这样大量的融合蛋白是否会影响RNA的定位、稳定性和行为。尽管存在这些不足之处，MCP-MS2系统仍是目前在活细胞中用于RNA成像的“黄金标准”，被广泛用于研究单分子水平上的RNA行为。更直接地说，MCP-MS2系统可将感兴趣的RNA与荧光素结合的RNA适配体融合，其具体流程如图1所示。
新一代的标记技术和高级成像技术的引入可能是解决方案之一，以提高标记的时空分辨率，同时结合高级成像技术，如单分子成像或超分辨率显微镜，有望更准确地揭示RNA在活细胞中与RBP结合的动态变化。
图1 MCP-MS2 RNA示踪系统。
RNA mimics of fluorescent proteins（RMFPs）系统
2011年，Jafrey团队提出了一种思路，用于生成与GFP中的荧光体相似的荧光素结合的RNA适配体。这些RNA-荧光素复合物形成了一个跨足可见光谱的调色板，其中一种RNA-荧光素复合物被命名为Spinach，它类似于增强型GFP，并且产生与荧光蛋白相当亮度的绿色荧光，其可表现出显著的抗光漂白性能，Spinach融合的RNA能够在活细胞中进行成像。这些RNA的GFP模拟物为荧光RNA的基因编码提供了一种途径（图2）。
图2 Spinach RNA示踪系统。(Paige et al., 2011)
尽管Spinach使用简单而有前途，但它们存在显著的限制，如相对较低的亮度、仅有绿-黄色的颜色、有限的热稳定性或光稳定性，或多聚体性质，这可能阻碍它们在活的哺乳细胞和体内的广泛应用，特别是在mRNA成像方面，其丰度比核糖体RNA和转移RNA低几个数量级。Pepper与Clivia系统
2019年，华东理工大学杨弋研究团队基于RMFPs的思路推测：RMFPs在发展过程中所面临的许多挑战可能是由于，RMFPs与小而灵活的类似GFP的荧光体结合的亲和性和热稳定性较低。这是因为将这些小而灵活的GFP样荧光体固定在复合物的整体三级结构中是一项艰难的任务。为了克服这一问题，研究团队设计了一种合成染料，即（4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-苯基甲基）-青苯乙腈（HBC），其在结构上具有刚性电子受体和强电子给体。与GFP荧光体类似，HBC在溶液中是非荧光的，但在受到分子内运动的限制时会强烈发光。研究团队采用系统进化的配体指数富集（SELEX）方法，选择了与HBC结合的适配体，并发现其中一种名为D11的适配体，在体外成功增强了HBC的荧光超过3000倍，并将D11适配体命名为Pepper（图3）。此外，当Pepper在大肠杆菌细胞中表达时，显示出明亮的荧光。这一创新为克服RMFPs的限制提供了一种新的途径，为RNA荧光成像技术的发展开辟了新的可能性。
图3 Pepper-HBC RNA示踪系统（Chen et al., 2019）。
基于Pepper-HBC RNA示踪系统的经验，杨弋团队以具有大斯托克斯位移（荧光光谱较相应的吸收光谱红移）红色荧光蛋白的荧光基团开发出了Clivia-NBSI RNA示踪系统。相较于已有的RNA示踪系统，Clivia-NBSI系统具有更大的斯托克斯位移，并表现出低背景荧光以及良好的膜透过性和低细胞毒性（图4）。此外，大的插入物可能会影响小ncRNA的定位和功能，而Clivia的小尺寸（30nt）为在活细胞中标记大量小ncRNA打开了巨大的机会。
图4 Clivia-NBSI RNA示踪系统（Jiang et al., 2023）。案例展示
既然我们已经了解了RNA示踪的方法，下面就一起来了解下最新Pepper及Clivia系统的应用案例吧！
案例一
2023年7月21日，中科院北京生命科学研究院李幸团队在Nucleic Acids Research（IF：14.9）上发表了题为“Genetically encoded RNA-based sensors with Pepper fluorogenic aptamer”的研究性文章，该团队将Pepper转变为一种基于RNA的传感器，用于测量细胞内分子的丰度和信号。该团队设计了用于体内外代谢物检测的传感器。首先合理设计了一个基于Pepper的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）传感器，揭示了在活体人类细胞中随时间变化的SAM信号功能，并追踪了SAM的生物合成途径，呈现出细胞间变异。此外，利用该传感器，该团队还监测了MATase活性，并确定了在活体个体人类细胞中MATase抑制剂的抑制作用（图5）。图5 基于Pepper的SAM传感器系统（Chen et al., 2023）。
案例二
2023年9月18日，华东理工大学杨弋团队在Nature Methods（IF：48.0）上发表了题为“Large Stokes shift fluorescent RNAs for dual-emission fluorescence and bioluminescence imaging in live cells”的文章，该团队开发出具有大斯托克斯位移的RNA失踪系统-Clivia，并成功用于可视化活细胞中的非编码RNA（图6）。同时，基于Clivia系统可被蓝光或绿光激发的特点，该团队还开发出结合Clivia及Nluc荧光素酶来判断RNA及特定蛋白质互作的系统，为实时观测RNA及蛋白质互作提供了新的思路。
图6 基于Clivia与Nluc的RNA及蛋白质互作系统（Jiang et al., 2023）。
参考文献
Chen Z, Chen W, Reheman Z, et al. Genetically encoded RNA-based sensors with Pepper fluorogenic aptamer[J]. Nucleic Acids Research, 2023, 51(16): 8322-8336.
Chen X, Zhang D, Su N, et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs[J]. Nature Biotechnology, 2019, 37(11): 1287-1293.
Jiang L, Xie X, Su N, et al. Large Stokes shift fluorescent RNAs for dual-emission fluorescence and bioluminescence imaging in live cells[J]. Nature Methods, 2023, 20(10): 1563-1572.
Paige J S, Wu K Y, Jaffrey S R. RNA mimics of green fluorescent protein[J]. Science, 2011, 333(6042): 642-646.
