PCR技术起源起于20世纪80年代，经过多代技术更迭，在极大程度上推进了分子生物学技术的发展，目前已广泛应用于医学、微生物学、动物学、植物学等领域，如果大家想了解PCR技术的分类，可参考“PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR你真的能区分的开吗？”一文。本期，小医将重点介绍二代PCR——实时荧光定量PCR（qPCR）技术中的荧光探针法，如果大家有感兴趣的PCR方法，也可留言告诉小医哟！
背景介绍
qPCR技术自问世以来，就以其高特异性、高灵敏性、可定量、无污染的优势，获得了广泛应用。其中荧光PCR探针检测技术主要是根据荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）原理设计相应的荧光标记核酸探针，通过PCR反应对相应靶DNA进行均相定性定量测定。首先，一起来学习下什么是FRET吧？
1948年，FRET技术作为采用物理方法检测分子间相互作用的方法首次被提出，即一种检测蛋白-蛋白互作的技术，其最大优势是能从“时间、空间、动态、连续”对活细胞中的蛋白相关作用进行检测。FRET的产生必须具备两个条件，一是供体的发射光谱和受体的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠；另外供体和受体之间的距离必须足够小（一般小于10nm）。其检测原理即将两种荧光蛋白分别与两种目的蛋白融合表达，形成荧光供体蛋白与荧光受体蛋白，当两个融合蛋白之间的距离在5~10nm的范围内，则供体发出的荧光可被受体吸收，并激发受体发出荧光，此时通过测量供体荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近，供体所发出的荧光被受体接收的量就越多，检测器所接收到的荧光就越少（图1）。
图1 FRET的原理机制（Choi et al., 2021）。
荧光探针的分类
荧光PCR探针检测即在PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性荧光探针（寡核苷酸）。根据检测中所使用的荧光探针分类，目前已经开发出TaqMan探针、分子信标（Molecular Beacon，MB）、蝎形探针（Scorpion Probes）、链置换探针、Eclipse探针、Scorpion探针、单标探针（Single-labeled Probe）以及双杂交探针（Dual Hybridization Probe）、双淬灭探针、锁核酸探针（Locked Nucleic Acid，LNA）、肽核酸探针（Peptide Nucleic Acid，PNA）等多种荧光探针相关技术。下面，就和小医一起来学习下一些常见探针的背景知识及其在病毒检测中的应用吧！1、TaqMan探针
TaqMan探针即水解探针，作为荧光定量PCR以及临床诊断的“金标准”，长久以来被广泛应用，1996年被首次报道（Heid et al., 1996）。TaqMan探针原理依赖于5’端标记的荧光报告基团（R，常见FAM）和3’端标记淬灭基团（Q，常见TAMRA）以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列，当TaqMan探针完整且报告染料非常接近淬灭染料时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在PCR扩增时，模板DNA变性解链，TaqMan探针特异性结合到目标基因处，而Taq酶具有5′-3’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团与淬灭基团分离，检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比（图2）。
图2 TaqMan探针检测示意图（Butler J M., 2011）。
关于TaqMan探针修饰基团的选择，我们一般需要注意以下几点：1）荧光定量PCR仪的适配；2）荧光基团种类的搭配，下表列出了常见的报告基团和淬灭基团的组合形式；3）最常用的基团标记方式为5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；4）不建议在中间标记淬灭基团。
近年来，随着生物技术的发展，研究人员也对TaqMan探针进行了不断地改造，研究出了MGB探针，即除了两端分别标记荧光基团和淬灭基团外，探针的3’或5′端还连接有小沟结合物（Minor Groove Binding，MGB），MGB多为小分子三肽（如二氢环化吲哚卟啉-三肽（DPI3）），可与双链DNA的小沟进行非共价结合，稳定DNA结构，提高探针的TM值，增加杂交反应的特异性。并且MGB探针也发展出了MGB-TaqMan探针、MGB-Pleiades探针、MGB-Eclipse探针等多种类型。由于篇幅有限，此文中对MGB探针不进行详细介绍，感兴趣的同学可自行查阅资料学习哟！2、分子信标（Molecular Beacon，MB）
MB是一种单链双标记荧光探针，通过探针两端的互补茎序列（约4~6nt）保持发夹环结构（约20~25nt），通过该结构，5’和3’端保持紧密接近，探针的5’和3’端分别含有报告基团和淬灭基团，报告基团和淬灭剂的接近导致报告基团的天然荧光发射被淬灭（图3）。与TaqMan探针类似的是探针一端的荧光染料发出的荧光被附近的非荧光淬灭剂抑制；但与TaqMan探针相反的是MB在扩增过程中不会降解，而是保持完整，并且必须在每个循环中与靶标结合才能产生可测量的荧光。也就是说，MB与其特定的靶序列杂交，导致发夹环结构打开，并将5’端报告基团与3’端淬灭基团分开，当淬灭基团不再靠近报告基团时，就会发出仪器可监测的荧光，测得的荧光信号与目标DNA的量成正比。
图3 典型的MB结构（May et al., 2017）。3、双杂交探针（Dual Hybridization Probe）
双杂交探针即在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团（由特定波长激发的可将能量转移至荧光受体基团的基团）和荧光受体基团（可从荧光供体基团接收能量，并利用该能量发射荧光的基团），两基团的激发光光谱有一定程度的重叠，且两基团非常接近（1~10nm，即1~5nt），两条探针与靶核酸的杂交位置相互邻近，此时产生FRET现象，荧光强度与PCR反应中的DNA合成量成正比（图4）。
图4 双杂交探针的作用方式（Artika et al., 2022）。4、蝎形探针（Scorpion Probes）
蝎形探针又叫蝎形引物，因形状类似蝎子而得名，是另一种专为PCR产物的特异性检测而开发的荧光检测方法，与MB类似，由于探针5’和3’端存在互补的茎序列，蝎形探针采用茎环结构，荧光基团连接到探针的5’端，淬灭基团连接到探针的3’端，特定探针序列保留在发夹环内，通过PCR终止子的不可扩增单体连接到PCR引物序列的5’末端（图5）。与MB不同的是，蝎形探针3’端带有一段PCR特异性引物，可与相应的靶核酸结合，所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序列杂交结合，茎环结构打开，荧光基团不再被淬灭而被发射出来，荧光强度与扩增产物的含量呈正比。
图5 蝎形探针机制示意图（Thelwell et al., 2000）。
荧光PCR探针在病毒检测中的应用
荧光PCR探针检测技术在病毒快速检测中具有开发速度快、灵敏度高、特异性好等特点，适用于新发传染病的快速筛查和诊断、对早期症状不明显的病毒传染病进行检测以及对具有相似病症的多种病毒感染的诊断等。下面就一起来看看荧光PCR探针检测技术在病毒快速检测中的几个应用案例吧。例子一
2022年10月份，Baccari等人在Environmental Science and Pollution Research上发表了题为“A new TaqMan real-time PCR assay to detect Parachlamydia acanthamoebae and to monitor its co-existence with SARS-COV-2 among COVID-19 patients”的研究性文章。团队在社区获得性肺炎（CAP）的大背景下，通过收集环境水样与临床样本，设计引物探针，并分析其特异性，最终开发了一种新的TaqMan-PCR检测方法，用于快速检测和绝对定量棘阿米巴副衣原体（Parachlamydia acanthamoebae，P. acanthamoebae），为棘阿米巴病原菌感染早期的定量检测提供了一种适宜的、快速的、不依赖于培养的检测方法。将该方法应用于含有多种细菌细胞的各种临床和环境样品，证实了其高度的特异性和敏感性（图6）。这些特点表明，该方法可作为疫情期间常规诊断和大规模筛选的便利工具。
图6 本研究部分结果展现（Baccari et al., 2023）。例子二
2023年11月份，Ugwu等人在Open Veterinary Journal上发表了题为“TaqMan probe-based qPCR method for specific detection and quantification of fowl adenovirus 8b challenge from chickens inoculated with live attenuated or inactivated virus”的研究性文章。团队在COVID-19、SARS-CoV-2、甲型流感以及乙型流感导致患者出现相似症状的背景下，开发了一种基于TaqMan探针的新型多重RT-qPCR检测方法，通过使用多个引物和探针组结合不同的靶标来特异性扩增靶标序列，以廉价且省时的程序来检测和区分临床样本中的病毒类型（图7）。
图7 用于设计和开发多重RT-qPCR检测的简单工作流程（Ugwu et al., 2023）。
参考文献
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Baccari O, Barkallah M, Elleuch J, et al. A new TaqMan real-time PCR assay to detect Parachlamydia acanthamoebae and to monitor its co-existence with SARS-COV-2 among COVID-19 patients[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2023, 30(7): 17564-17572.
Bertolini E, Figàs-Segura À, Álvarez B, et al. Development of TaqMan real-time PCR protocols for simultaneous detection and quantification of the bacterial pathogen Ralstonia solanacearum and their specific lytic bacteriophages[J]. Viruses, 2023, 15(4): 841.
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Ugwu C C, Hair-Bejo M, Omar A R, et al. TaqMan probe-based qPCR method for specific detection and quantification of fowl adenovirus 8b challenge from chickens inoculated with live attenuated or inactivated virus[J]. Open Veterinary Journal, 2023, 13(2): 171-178.
