小G蛋白结构为单体分子，在细胞信号通路中发挥“分子开关”的功能，参与调控很多生物学过程。其“分子开关”功能的实现是由于在细胞中存在一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（Guanine Nucleotide Exchange Factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine Nucleotide Dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase Activating Protein, GAP）。因此小G蛋白有一个共同特点，即当结合了GTP时成为活化形式，可作用于下游分子使之活化，传递细胞信号；而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则恢复到非活化状态。

基于序列同源性，小G蛋白家族被分成若干亚家族，包括Ras、Rab、Rho、Arf和Ran等。其中Ras是第一个被发现的小G蛋白，它是Ras基因的产物。每个亚家族在细胞中起着不同的作用，Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导，调节细胞分化过程；Rho蛋白调控肌动蛋白重组过程，对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab和Arf蛋白参与细胞膜转运；Ran蛋白在核孔位置调节着蛋白和RNA分子的运输过程。

目前在真核细胞中，研究者已经发现了超过100种小G蛋白，并且证实其在多种细胞反应中具有开关样作用。

二、小G蛋白活性检测方法

研究小G蛋白的方法包括Pull-down与G-LISA检测。Pull-down是传统检测小G蛋白活化水平的主要方法，可用于测定活性的GTPase（小G蛋白）亚型。其主要原理是用包被效应蛋白的亲和琼脂糖微珠选择性结合有活性的GTPase，用SDS-PAGE电泳及WB检测小G蛋白信号。传统方法虽然经济实惠，但不可避免有一些缺点，为了克服这些缺点，Cytoskeleton公司研发了G-LISA的检测方法。G-LISA是一种改进的ELISA，实验原理是用包被效应蛋白的96孔板选择性结合有活性的GTPase，可用于测定传代细胞系、原代细胞裂解液及组织裂解液中有活性的GTPase，快速简便地检测GTPase活化水平，使GTPase定量的准确性增加。

01

Pull-down检测小G蛋白活性的操作步骤

（1）构建GST-效应蛋白原核表达载体；

（2）GST-效应蛋白的表达与纯化；

（3）纯化的GST-效应蛋白与GSH包被的琼脂糖微珠结合；

（4）用于Pull-down实验的细胞裂解液的制备；

（5）将GST-效应蛋白与GSH-琼脂糖微珠复合物与含有小G蛋白的细胞裂解液一起孵育；

（6）离心获得GST-效应蛋白-GSH-琼脂糖微珠-结合的小G蛋白复合物；

（7）洗涤除去裂解物中未结合的细胞蛋白；

（8）将复合物煮沸，使其变性，并使蛋白质从珠子中分离出来；

（9）SDS-PAGE电泳及Western blot检测。

图2 Pull-down检测R5BD活性的流程图（Qi Y et al., 2015）。

02

G-LISA检测小G蛋白活性的操作步骤

（1）效应蛋白的受体结合域（RBD）包被于96孔板；

（2）将细胞系或原代细胞裂解液、组织裂解液加入96板；

（3）孵育后洗去未结合的蛋白；

（4）依次加入特异性的一抗和HRP-二抗进行孵育结合；

（5）利用合适的HRP的水溶性底物或化学发光试剂显色。

注：待测样本中GTP（活化状态）结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而GDP（无活性状态）结合形式蛋白则不结合。

图3 G-LISA实验原理（来源于网络）。

03

Pull-down和G-LISA技术对比

参考文献

Prieto-Dominguez N,Parnell C,Teng Y. Drugging the Small GTPase Pathways in Cancer Treatment: Promises and Challenges[J]. Cells,2019,8(3).

Qi Y, Liang Z, Wang Z, et al. Determination of Rab5 activity in the cell by effector pull-down assay[J]. Rab GTPases: Methods and Protocols, 2015: 259-270.

Song S, Cong W, Zhou S,et al.Small GTPases:Structure,biological function and its interaction with nanoparticles[J].Asian journal of pharmaceutical sciences, 2019, 14(1):10.