2、CDS MRE需要广泛的3’碱基配对才能发挥作用

进一步的，作者发现，当在萤光素酶报告基因载体中引入MRE突变，重新建立种子碱基配对时（图5a），3’UTR中的MRE发挥作用（图5b）。为了确定3’碱基配对对于MRE在CDS中的作用是否至关重要，在MRE中引入了突变，发现3’碱基配对确实对于MRE发挥作用至关重要，即使在恢复种子碱基配对后也是如此（图5c、d）。

接下来，作者通过挖掘CLASH数据，确定了两类假定MRE。第一类（即PRDM4、SAFB、SNRPA和NDRG1）显示出与Let-7b的5’和3’碱基配对潜力，并且当插入荧光素酶报告基因时，无论在3’UTR或CDS中，所有荧光素酶活性均受到抑制（图5e）；第二类（即BAT2、BRPF1、CD99和ERAP2）与miR-20a MRE表现出明显的相似性，具有与Let-7b的大量3’配对潜力，但在5’处缺乏典型的碱基配对种子，当放入荧光素酶报告基因时，所有这些都只在CDS中发挥作用（图5f）。

图5 CDS和3’UTR靶向miRNA需要在3’端和5’端的种子处进行不同的碱基配对。

3、CDS靶向miRNA的功能依赖于Ago，而非GW182

由于Ago蛋白和GW182都是3’UTR区的标准MRE功能的必需因子。作者为了测试CDS区的MRE发挥功能时是否也需要这两种蛋白，分析了Ago2缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）以及经Ago1-4 siRNA库处理的HeLa细胞中的多个非典型MRE。结果发现，这些非典型MRE的功能在Ago2缺失的MEF中部分受损，在Ago1-4敲低的HeLa细胞中完全消失，表明CDS MRE需要Ago蛋白才能发挥作用（图6a、b）。同时，作者还检测了敲低TNRC6家族成员后，CDS MRE活性及DAPK3的表达，结果并无显著差异（图6c、d）。在CDS中，DAPK3中的miR-20a MRE在3’端具有强碱基配对相互作用，但5’种子中的最小碱基配对仍然允许一定程度的Ago2招募，但不能招募GW182。

图6 CDS靶向miRNA的方式是Ago依赖性，而非GW182。

4、CDS靶向miRNA诱导翻译终止

为了研究miRNA在CDS中发挥作用时如何抑制翻译，作者利用报告基因系统探究了Let-7b对帽依赖性报告基因的抑制作用（图7a）。进一步的，作者将DAPK3的MRE插入到荧光素酶报告基因中，并将全长34kD FLAG荧光素酶蛋白截短至约28kD，为了进行比较，作者还设计了终止密码子或非功能性MRE，即在同一位置的3’端有3个碱基不匹配（图7b，上）。结果显示，野生型荧光素酶产生了预期的34kD条带，并在CDS中检测到了含有功能性MRE的报告基因的28kD条带，这种截短的产物取决于功能性MRE，在同一位置插入突变型MRE以及当细胞与miR-20a antagomir共转染时，条带显著减弱（图7b，下）。

此外，作者还采取了“2A”策略，即在GFP和MCherry之间插入P2A自切割肽序列，发现与突变型MRE相比，MCherry对来自DAPK3的野生型miR-20a MRE的反应有所减少，miR-20a过表达后进一步减少，而miR-20a antagomir减弱了这种MRE依赖性效应（图7c）。

图7 CDS靶向miRNA导致翻译终止。

5、CDS靶向miRNA对核糖体结合的影响

随后，作者进行了核糖体分析，结果在miR-20a转染前后确定了特定的Ago2峰（图8a）。相对于未改变的Ago2峰或mRNA中的随机位置，CDS和3’UTR中诱导的Ago2峰与miR-20a的碱基配对潜力升高（图8b）。接下来，作者通过单个转录本的核糖体分析检验了特征化DAPK3转录本的数据，发现了Ago2的明显诱导以及特征化DAPK3转录本上RFP的适度增加，miR-20a MRE响应miR-20a过度表达，而RNA-seq谱基本保持不变（图8c）。然后，通过将RPF与miR-20a诱导的Ago2峰的中心对齐，发现，这些积累的RPF不受miR-20a过表达的影响（图8d）。此外，作者还发现含有miR-20a转录本的RNA衰变会诱导3’UTR中的Ago2峰，CDS中Ago2峰的转录本略有减少，但CDS中具有或不具有Ago2结合的转录本之间的翻译效率几乎没有差异（图8e）。

最后，作者在荧光素酶报告基因3’端附近设计了miR-20a MRE，但仍在CDS区域内，发现在同一位置放置终止密码子不会影响荧光素酶活性，表明最后一个C端序列对于荧光素酶活性来说不是必需的（图8f，左下）。相比之下，miR-20a MRE的存在降低了内源性miR-20a的荧光素酶活性，而这种效应可以用蛋白酶体抑制剂MG132来“挽救”（图8f，右下）。