将绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生蛋白、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）等报告基因，与目标蛋白基因融合在一起，由目标蛋白的引导信号进行亚细胞定位，对报告蛋白的光信号进行跟踪和观察，从而确定目标蛋白的定位。该方法是目前使用最广泛的蛋白质亚细胞定位研究方法。

2、免疫荧光标记定位法

将免疫反应与化学光学信号相结合，通过特异性的荧光标记抗体与目标蛋白（抗原）结合，通过荧光信号检测，确定目标蛋白的亚细胞位置。目前抗体标记信号不局限于荧光素，还有同位素、酶、胶体金颗粒、纳米金属颗粒等。

3、亚细胞结构分离定位法

通过超速离心等技术分离各亚细胞结构，然后从分离物种进一步提取蛋白质，对目标蛋白质进行分析或检测，从而获得目标蛋白的定位。本方法适合研究某蛋白质组级别的细胞器定位，通常与双向凝胶电泳分离和质谱技术相结合。

4、生物信息学预测

通过生物信息学手段，借助一些在线工具对蛋白的亚细胞定位信息进行预测，这种方法可以在短时间获得大量蛋白的预测信息，不仅辅助于实验，还能省时省力节约成本。这里推荐一些在线预测亚细胞定位的网站：

（1）http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Hum-mPLoc3/

（2）http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/

（3）https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi

（4）https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/multiloc2/webloc.cgi

（5）https://wolfpsort.hgc.jp/

若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。

2、为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

3、为什么要提供GFP空载的对照图片？

（1）作为整个实验过程中的操作参照，可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。

（2）作为载体体系的参照，确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。

4、拍摄时为什么有明场通道？

（1）显示细胞状态，有活力的细胞应该有正确且明显的细胞形态，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡。

（2）显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。

5、为什么不先对基因做预测，在预测的结果上直接做共定位？

不同的预测网站有不同的计算方法，同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的，对于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推荐先做普通定位，根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。

6、适用于什么实验场景？

（1）基因功能研究，文章里总少不了这一项。

（2）研究蛋白相互作用，与酵母双杂实验结果相互验证。