蛋白-蛋白相互作用是蛋白质结构与功能研究中最重要的方面之一。今天我们来学习一个蛋白质体外结合实验——Pull-down实验，Pull-down实验，又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术，也是一种验证酵母双杂系统的体外试验技术。蛋白Pull-down可用于验证已知蛋白或肽的相互作用，也可以用来筛选与已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真实反应细胞内蛋白质之间的相互作用，因为在体外相互作用的蛋白质在正常生理条件下不一定会相互结合。
“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得，这种方法简单易操作。
基本原理：
GST Pull-down的原理主要是利用GST对GSH的亲和性，将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，再通过DNA重组技术将已知蛋白X与GST融合，GST-X融合蛋白与GSH-琼脂糖珠形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X”复合物，若环境中存在与X蛋白互作的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互作的蛋白即可被分离并检测。
操作步骤：
样品处理—GST/His-诱饵蛋白原核表达载体构建—GST融合蛋白表达—GST融合蛋白纯化—Pull-down捕获猎物蛋白—SDS-PAGE电泳—Western blot或LC-MS/MS
基本原理：
针对目标区域体外制备脱硫生物素标记的特异性DNA探针，使其与待测蛋白液孵育，可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合，形成“生物素化DNA-蛋白质”复合物。生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，采用链霉亲和素磁珠将靶DNA及其结合蛋白从待测蛋白液中分离出来，洗涤后，将非特异性结合蛋白去除，最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，通过Western blot检测洗脱液中是否有待测蛋白；通过LC-MS/MS技术检测靶DNA的潜在结合蛋白并鉴定蛋白质类型。
操作步骤：
样品处理—探针标记—蛋白与探针共孵育—Western blot或LC-MS/MS检测
DNA Pull-down的优点:
1、可富集分析低丰度蛋白；
2、探针制备简便，周期短；
3、获得特异性蛋白与下游蛋白质检测技术兼容。
DNA Pull-down的缺点:
1、长链探针往往存在非特异结合现象；
2、反应条件要求无核酸酶；
3、体外实验，相对体内实验存在一定弊端。
基本原理：
RNA Pull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，通过生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用，使其与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，如果检测蛋白为已知蛋白，可通过Western blot实验检测特定RNA结合蛋白是否与RNA相互作用；如果检测未知蛋白，则可结合质谱（MS）进行鉴定特定RNA结合蛋白，以鉴定蛋白质类型。
操作步骤：
样品预处理—生物素探针标记RNA—RNA抽提—细胞裂解—磁珠富集RNA—RNA结合蛋白孵育—RNA结合蛋白洗脱—Western blot或LC-MS/MS检测
RNA Pull-down的优点：
1、可富集检测低丰度RBPs-RNAs复合物；
2、体外直接转录目的RNA作为诱饵，避免了RNA互补探针导致的非特异性结果；
3、质谱鉴定具有高效、通量大的特点，可一次性获得可能与目的RNA互作的蛋白。
RNA Pull-down的缺点：
1、受磁珠的影响，不同的磁珠会产生不同的实验结果；
2、实验成本较高，应用范围有限；
3、只能检测到蛋白和RNA结合，不能检测到RNA和其他物质结合，不能用来研究RNA的功能性相互作用。
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