作为最难治疗的乳腺癌亚型，三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种生物学上和临床上具有异质性的疾病，至今尚缺乏有效的治疗干预手段。由于TNBC是一类富含铁且富脂质的肿瘤，所以诱导铁死亡成为值得探索的治疗策略。今天向大家分享一篇复旦大学团队的研究成果（就是那个将TNBC进一步分为若干亚型的团队），近期发表于《Cell Metabolism》（2022年IF=31.373，JCR分区=Q1），文章名为：“Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy”。
该研究系统地综合分析TNBC的铁死亡异质性，并着重强调：
1）TNBC的管腔雄激素受体（luminal androgen receptor，LAR）亚型对铁死亡诱导剂，特别是谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抑制剂异常敏感；
2）雄激素受体（androgen receptor，AR）双重调控LAR肿瘤的铁死亡；
3）GPX4抑制剂联合免疫疗法是治疗LAR肿瘤的新型策略。
1.整理大型TNBC队列（cohort）的多组学数据（multiomics data），研究细胞铁死亡。
2.TNBC的异质性表型包含铁死亡相关的代谢物和代谢途径。
3.TNBC的管腔雄激素受体（LAR）亚型的特征包括氧化磷脂酰乙醇胺（oxidized phosphatidylethanolamines）上调和谷胱氨酸代谢（特别是GPX4）上调，其促使GPX4抑制剂诱导铁死亡。
4.GPX4抑制剂不仅诱导肿瘤的铁死亡，还增强抗肿瘤免疫。
5.相比于单药治疗，GPX4抑制剂和PD-1抗体（anti-PD-1）的联合运用产生更好的治疗效果。
6.临床诊断的结果显示为：免疫治疗组的患者中，GPX4的高表达量与低细胞溶解分数和不良预后显著相关。
7.本研究阐述了TNBC铁死亡图谱，并采用免疫疗法的组合策略治疗LAR肿瘤。
1.明确TNBC亚型中铁死亡相关特点的异质性
作者使用多组学的TNBC数据集（n=465），其中，360份样本含有转录组数据，279份样本含有全外显子组测序（WES）相关的结果，401份样本含有肿瘤体细胞上的拷贝数变化（SCNA）数据，以及330份样本含有代谢组学数据（图A）。鉴于铁死亡和细胞代谢的连接强度（图B），使用数据集中转录组学和代谢组学的数据推断TNBC亚型——间质型（MES）、管腔雄激素受体型（LAR）、免疫调节型（IM）和基底样免疫抑制型（LAR）的铁死亡活性，也利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算20类铁死亡相关代谢途径的富集程度（图C&D）。此外，对比TNBC亚型中大量铁死亡相关的代谢物——其包括氧化性磷脂酰乙醇胺（OxPE）和脂肪酸（FA）（图D）。另外，结果显示MES亚型有类似于乳腺癌干细胞的特点（图C）。而在mRNA和蛋白质水平上，MES亚型展现为较低的HAMP表达，即铁平衡的负调节因子（图E&F）。在TNBC的细胞系中，也验证了铁代谢在MES中的调节异常（图G）。另一方面，软脂油酸和十八烯酸促进T细胞触发的铁死亡，其含量在LAR肿瘤中显著上升（图D&图H），而LAR亚型的脂质过氧化水平显著提高（图I）。总之，TNBC亚型显示出与铁死亡途径相关的特征。
2.明确GSH代谢显著抑制LAR肿瘤的铁死亡
对比非LAR的肿瘤和正常组织后，结果显示：GSH（谷胱甘肽）代谢显著地抑制铁死亡（图A&B）。GSH是肿瘤细胞中一种主要的小分子抗氧化剂，其由半胱氨酸、谷氨酸盐和甘氨酸形成（图C）。对比GSH循环中核心代谢物的含量时，发现GSH相关的代谢物——比如L-胺酸、L-氧化脯氨酸、甘氨酸和半胱氨酰甘氨酸——在LAR肿瘤中显著提高（图D&E）。在TNBC细胞系中，也发现了LAR型细胞的GSH/GSSG高比率（图F），且GSH代谢是LAR亚型中必不可少的抑制铁死亡的通路（图G）。此外，在GSH通路的代谢基因中，LAR肿瘤与非LAR肿瘤间GPX4表达具有显著差异（图F&H&I）。综上所述，GPX4是GSH代谢中潜在的决定因素，在LAR肿瘤中抑制铁死亡。
3.对多种铁死亡诱导剂独特的敏感性强调GPX4在LAR肿瘤中的重要性
铁死亡诱导剂包括erastin、PX-12、FIN-56、RSL3和ML162（GPX4抑制剂），本研究将这些诱导剂分别处理LAR、非LAR和非TNBC细胞系，并评估它们诱导细胞铁死亡的效果（图A）。经IC50实验结果显示，GPX4对LAR肿瘤中的铁死亡体内平衡至关重要（图B）。细胞克隆形成实验进一步确认，LAR肿瘤细胞对GPX4抑制剂的灵敏度最高（图C）。
4.AR调控LAR肿瘤中GPX4的表达量
通过整合基因组和转录组分析比较LAR和非LAR肿瘤后发现，LAR特定的改变与GPX4的表达量呈显著相关性（图A）。GSEA结果显示：在LAR肿瘤中，特征基因的一些通路被激活，譬如脂肪酸代谢通路、雄激素反应通路和过氧物酶体通路（图B）。基因组分析表明：在LAR中，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶（PI3K）信号、受体酪氨酸激酶（PTK）信号和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路发生突变，而9p21.3、9p24.2和18q11.2均缺失（图C&D）。Spearman相关性分析显示：脂肪酸新陈代谢、胆汁酸代谢、雄激素反应、脂肪形成、胆固醇内稳态、PI3K信号突变、MAPK信号突变和溶质运载蛋白家族1成员1（SLC1A1）的表达与GPX4的表达量呈正相关（图E）。此外，AR抑制剂（比卡鲁胺）和GPX4抑制剂（RSL3）明显降低GPX4的蛋白水平（图F）。而HEK293T细胞中过表达AR导致GPX4的mRNA和蛋白水平显著增加，而抑制AR的表达水平显著降低MDA-MB-453细胞和MFM-223细胞中GPX4的表达量（图G&H）。总之，AR调控LAR肿瘤中GPX4的表达水平。
5.AR结合GPX4的启动子并激活其表达
在转录水平上，AR上调GPX4的表达量（图G&H）。荧光素酶报告基因实验显示，GPX4仅-2500 bp~-2000 bp的区域结合AR并上调荧光素酶信号（图I）。比对该区域的AR结合部位（ABSs）后，发现AR识别4个基序（图J），这些基序的突变抑制AR诱导的转录上调（图K）。总而言之，AR结合GPX4的启动子，并提升GPX4的表达量。
6.AR调控铁死亡的双重角色暗示：相比于靶向AR，靶向GPX4对LAR的TNBC患者更为重要
不同于AR的抑制剂，GPX4的抑制剂提高脂质过氧化的水平，并促进铁死亡（图A&B）。此外，暴露于GPX4抑制剂后，脂质过氧化的生物标记物（即丙二醛）上调（图C）。另外，AR上调多不饱和脂肪酸（PUFA）生物合成，促进铁死亡；且AR会上调GPX4的表达，从而清除铁死亡过程中的脂质过氧化（图E）。因此，抑制GPX4使LAR肿瘤细胞发生铁死亡。
7.GPX4抑制剂减缓肿瘤生长，并对体内的肿瘤微环境进行重编程
TS/A是鼠的LAR肿瘤细胞系，其铁死亡相关通路富集，且在以往研究中已证明是LAR亚型（图A）。下调GPX4的表达量显著诱导肿瘤中的铁死亡，而非凋亡（图C&D）。根据免疫组化染色的结果，抑制GPX4显著提升环加氧酶2（PTGS2）、丙二醇（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）含量（图D）。相关性分析显示：GSH代谢与CD8+ T细胞/M1型巨噬细胞的比率呈负相关，而GSH代谢与M2型巨噬细胞/静止肥大细胞的比率呈正相关（图E）。综上所述，抑制LAR肿瘤的GPX4表达量显著促进铁死亡、减缓肿瘤生长且引发肿瘤微环境重编程，从而获得炎性表型。
8.GPX4抑制剂联合免疫检查点阻断（ICB）能有效治疗生物学特性类似LAR的肿瘤
使用GPX4抑制剂或阻断程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）治疗小鼠（图A）后发现：对比于单药治疗，GPX4抑制剂和抗PD-1抗体的联合治疗更有效阻止肿瘤增长（图B）。根据流式细胞术结果发现，该联合治疗诱导强烈的免疫反应，且PRF1+ CD8+ T细胞/GZMB+ CD8+ T细胞的比率大幅升高（图C）。此外，21位TNBC患者接受新辅助免疫治疗，并对其肿瘤样本进行转录组分析（图D）。高AR表达量的TNBC患者呈现铁代谢提高，且不饱和脂肪酸代谢和GSH代谢活力上升（图E）。其中，GSH新陈代谢和肿瘤炎症、STAT1、IFN-γ、PD-1表达量和M1型巨噬细胞的比例呈负相关，但与M2型巨噬细胞的比例呈正相关（图F）。不仅如此，在AR高表达组，GSH新陈代谢的提高与缺少病理学完全缓解（qCR）显著相关（图G）。而类似于LAR肿瘤，AR表达量较高的肿瘤显示相似的生物学特性（图H&I）。同样，GSH代谢与免疫相关的生物标记物呈负相关（图J）。另外，对比GPX4表达量和单个鼠细胞系对免疫治疗的反应后发现：ICB治疗抵抗的小鼠GPX4表达量更高（图K）。总之，在生物特征上，联合GPX4抑制剂和ICB适用于治疗类似LAR的肿瘤。
此研究结合TNBC患者的代谢组学、转录组学和基因组学，从而系统地挖掘出TNBC亚型中异质性TNBC的铁死亡表型。基于多组学数据和药物反应实验，本研究确定LAR是一类三阴性乳腺癌的亚型，其对铁死亡极其敏感；此外，GPX4对调控LAR肿瘤的铁死亡至关重要。在GPX4和PUFA的上游，AR参与铁死亡的双重过程。另一方面，联合GPX4和ICB有益于治疗类似于LAR的生物学特性的肿瘤。然而，本研究存在一定的局限性。首先，本研究需要进一步鉴定临床实践中联合GPX4抑制剂和ICB的治疗效果。其次，铁死亡的代谢调节剂并非是从TNBC多组学数据的相关分析得出的，此处无法排除其他调节机制的影响。最后，由于人体的LAR细胞系具有极有限的致瘤潜能，所以起源于鼠细胞的异种移植进行的GPX4抑制剂单药治疗无法完全代表体内的抗肿瘤活性。
