2022年10月12日，中山大学附属第三医院传染病科高志良团队在Cell Death & Disease上发表了题为“Mesenchymal stem cells exosomal let-7a-5p improve autophagic flux and alleviate liver injury in acute-on-chronic liver failure by promoting nuclear expression of TFEB”的研究性论文。在本研究中，团队发现间充质干细胞（MSCs）在急性慢性肝衰竭（ACLF）患者中存在治疗潜力，其可恢复ACLF小鼠受损的自噬通量，减轻肝脏损伤，并以促自噬依赖方式发挥肝保护功能；此外，团队还描述了转录因子EB（TFEB）与自噬活性之间的联系，即MSCs诱导的TFEB核转位增加可促进肝脏自噬。
机制上，团队证实，富含let-7a-5p的MSCs外泌体（MSC-Exo）可通过靶向MAP4K3来激活自噬，降低TFEB磷酸化，并且敲除MAP4K3可缓解炎症反应，诱导自噬，部分减弱抗let-7a-5p寡核苷酸的作用（图1）。总体而言，MSCs的肝保护作用部分得益于其外泌体let-7a-5p介导的自噬修复，为ACLF治疗靶点提供了新的见解。
近年来，MSCs由于其独特的免疫调节和再生能力，在改善炎症和退行性疾病治疗方面的潜在用途受到了广泛关注。前期研究指出，MSCs移植可明显提高短期生存率，降低严重感染等并发症的发生率（Lin et al., 2017）。作为新发现的小直径囊泡——外泌体（Exosomes），是细胞外囊泡的一种，由MSCs分泌，通过将miRNA和蛋白质的内容物转移到受体细胞来介导其疗效（图1）。与MSCs相比，外泌体具有相同的免疫调节功能，且具有肝脏分布的优势，避免了细胞外基质（ECM）应用中的衰老和排斥问题，因此，检测MSCs外泌体（MSC-Exo）中的肝保护成分可能为ACLF的治疗提供新的策略。
图2 细胞外囊泡来源、含量和细胞间通讯示意图（Keshtkar et al., 2018）。
自噬是一种进化上保守的细胞内或细胞外应激或刺激的适应性反应，通过这种反应，受损的细胞器或错误折叠的蛋白质被降解并循环，以用于ATP的产生和蛋白质的合成，从而促进细胞生存和内稳态（图2）。自噬在大多数真核生物的生物学中占有中心地位，与核心代谢的调节密切相关。
前期研究表明，在轻度肝损伤的条件下，自噬信号级联可以被激活，以保护细胞免于死亡；而在更严重或更长时间的肝损伤情况下，自噬被抑制。多项研究表明，MSCs移植对肝脏的保护作用可通过调节自噬与减少肝纤维化或急性肝损伤的炎症反应来介导。然而，自噬是否参与MSCs治疗对ACLF的保护作用和具体机制尚不清楚。
2、体外模型：50μM四氯化碳处理正常人肝细胞系L02细胞，以模拟ACLF肝损伤严重程度；
3、外泌体分离与鉴定：培养MSCs，采用超速离心法分离外泌体后，对其进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）、蛋白质标记物（western blot）分析以及扫描电子显微镜（SEM）进行形态鉴定；
4、自噬通量检测：免疫组化与western blot检测自噬标志蛋白LC3与P62，并进行透射电镜观察；并进一步采用共聚焦显微镜鉴定mCherry-EGFP-LC3报告基因，以分析自噬情况；
5、机制研究：涉及实验包括shRNA腺病毒感染、细胞共培养、CCK8法检测细胞存活率、TUNEL-IF法检测细胞凋亡、流式细胞术分析细胞死亡率、qRT-PCR检测相关mRNA水平、双荧光素酶报告实验等。
Galluzzi L, Green DR. Autophagy-Independent Functions of the Autophagy Machinery. Cell. 2019;177(7):1682-1699.
Keshtkar S, Azarpira N, Ghahremani MH. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):63.
Lin BL, Chen JF, Qiu WH, et al. Allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure: A randomized controlled trial. Hepatology. 2017;66(1):209-219.
Lin D, Chen H, Xiong J, et al. Mesenchymal stem cells exosomal let-7a-5p improve autophagic flux and alleviate liver injury in acute-on-chronic liver failure by promoting nuclear expression of TFEB. Cell Death Dis. 2022;13(10):865.
