Science|Todd R Golub团队带你了解铜死亡

2022年8月3日 0条评论 1,306次阅读 0人点赞

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背景介绍

铜作为所有生物体必不可少的辅助因子已经在整个生物界得到了认可，也就是说，从细菌、真菌到动植物，铜都是生命的基本元素。研究显示，铜含量又是一把“双刃剑”，主动稳态机制通过跨浓度梯度发挥作用，将细胞内铜浓度保持在非常低的水平；而细胞内游离铜累积却对细胞有害，并且即使是适度的细胞内铜浓度也可能有毒，最终导致细胞死亡，即铜稳态变异可导致危及生命的疾病。尽管其他必需金属（如铁）的毒性机制已经确立（即铁死亡），然而，铜过载导致细胞死亡的机制一直不清楚。

图1 铜引发有毒线粒体蛋白质聚集机制示意图（Kahlson et al. 2022）。

2022年3月17日，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Peter Tsvetkov和Todd R. Golub团队在Science上在线发表了“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins”一文，确定了促进铜诱导死亡的关键基因——FDX1，并将这种铜离子载体诱导的细胞死亡新形式命名为“铜死亡”即Cuprotosis，开启细胞死亡机制研究新方向。

铜离子载体诱导一种特殊形式的调节性细胞死亡

铜离子载体是铜结合的小分子，其将铜穿梭到细胞中，因此是研究铜毒性的有用工具。多条证据表明，铜离子载体诱导的细胞死亡机制涉及细胞内铜积累，而不涉及小分子伴侣本身的作用。但以往研究数据指出，铜诱导毒性的机制较为矛盾，如诱导凋亡、非caspase依赖性细胞死亡、活性氧（ROS）、抑制泛素-蛋白酶体系统等。

为了进一步确定铜离子载体的细胞毒性是否依赖于铜本身，作者分析了铜离子载体杀伤潜力（图2A、B），以及铜离子载体介导的细胞死亡是否受调节，特别是短期暴露是否会导致不可逆的细胞毒性（图2C）。接下来，作者又深入探索了铜离子载体诱导细胞死亡的类型，发现其不同于已知的细胞死亡途径与机制（图2）。

图2 铜离子载体诱导一种特殊形式的调节性细胞死亡，非凋亡、非铁死亡、非坏死性凋亡。（A）PRISM再利用二级筛选；（B、C）指定金属离子载体诱导处理后的细胞活力；（D）Caspase 3/7活力；（E）Western Blot分析；（F）细胞克隆活力；（G）细胞活力热图；（H）细胞凋亡、坏死性凋亡和铁死亡示意图。

线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡

介导铜离子载体诱导的细胞死亡途径的一个暗示是，观察到更依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感性比进行糖酵解的细胞高近1000倍（图3A）；并且，线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂对铜离子载体的敏感性具有非常明显的影响，而电子传递链（ETC）复合物I和II的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取抑制剂可缓解细胞死亡，且对铁死亡无影响（图3B）。研究证实，铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸，而不是ATP的产生（图3C）。与此发现一致的是，低氧条件（1% O₂）可缓解铜离子载体诱导的细胞死亡，而常氧条件却无此作用（图2D），进一步强调了细胞呼吸在介导铜诱导细胞死亡中的作用。

然而，进一步的研究却发现，用铜离子载体处理并未引起基础呼吸或ATP连接呼吸的显著减少，但其显著降低了呼吸的剩余产能（图3E），表明铜不直接靶向ETC而是TCA循环的组成部分。以上这些结果建立了铜离子载体诱导的细胞死亡与线粒体代谢之间的联系，而不是ETC（图3F），进一步阐明了铜与TCA循环之间的精确联系。

图3 线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡。（A-D）不同处理条件下的细胞活力；（E）耗氧率（OCR）检测；（F）铜离子载体处理ABC1细胞后代谢物改变示意图。

FDX1与蛋白质脂质化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子

为确定介导铜毒性的特定代谢途径，团队进行了全基因组CRISPR/Cas9功能缺失筛选，以鉴定与铜离子载体诱导死亡相关的基因（图4）。敲除七种基因挽救了两种化合物的杀伤作用，并通过集中于3000种代谢酶的独立敲除筛选来验证。这与团队前期发现一致，即化学抑制剂ETC阻断由铜离子载体介导的细胞死亡（图3）。

单基因敲除的研究进一步证实，FDX1和LIAS的缺失赋予了铜诱导细胞死亡抗性（图4F、G），进一步加强了FDX1、蛋白质脂酰化机制之间的功能联系和铜毒性。以上这些结果与铜和线粒体代谢介导的蛋白质脂酰化的独特联系一致（图3A）。

图4 FDX1和硫辛酸基因是铜离子载体诱导的细胞死亡的关键介质。（A）全基因组CRIPS/Cas9阳性筛选；（B、C）Cu-DDC（B）或elesclomol-Cu（C）的（A）中筛选结果汇总散射；（D）硫辛酸途径示意图；（E）细胞以代谢基因为中心的CRISPR/Cas9基因敲除筛选中的最高命中散点图；（F）细胞活力；（G）细胞生长曲线。

FDX1调控蛋白质脂酰化

研究表明，蛋白质脂酰化是高度保守的赖氨酸翻译后修饰，已知仅在四种酶上发生，所有这些酶均涉及调节碳进入TCA循环的代谢复合物（Solmonson A, DeBerardinis RJ. 2018；Rowland et al. 2018）。并且已知蛋白质脂酰化是酶功能所必需的（图4D）。为探索FDX1是否可能是蛋白质脂酰化的上游调节剂，团队进行了以下三个分析：

（1）查找癌症依赖图（Cancer Dependency Map）之间协调依赖性的证据，发现FDX1和硫辛酸途径成分在整个细胞系中的生存力影响高度相关（图5A）；

（2）对208例人类肿瘤标本中的FDX1和硫辛酸进行免疫组织化学染色以及半定量光学显微镜评分，发现FDX1与脂酰化蛋白表达高度相关（图5B、C）;

（3）通过western blot或免疫组织化学，发现FDX1基因敲除导致蛋白质脂酰化完全丧失（图5D），并且还导致细胞呼吸显著下降，类似于LIAS本身缺失所观察到的水平（图5E）。

图5 FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节剂。

铜直接结合并诱导脂酰化DLAT的低聚

上述实验建立了铜毒性和蛋白质脂酰化之间的联系，但没有建立直接的机制联系。接下来，团队从细胞裂解物中纯化了DLAT和DLST，发现这些蛋白质与带铜树脂结合，但不与钴或镍树脂结合（图6A）。当通过FDX1缺失消除蛋白质脂酰化时（图5），DLAT和DLST不再结合铜（图6B），这表明硫酰基部分是铜结合所必需的。并且发现铜与脂酰化TCA循环蛋白的结合可导致DLAT的脂酰化依赖性寡聚化，这可通过非变性凝胶电泳检测到（图6B、C）。

类似地，针对铜离子载体敏感细胞的处理，增加了DLAT寡聚体和不溶性DLAT水平，而针对铜离子载体不敏感细胞系或FDX1敲除细胞的处理，仅在高浓度下才可导致DLAT寡聚化（图6D、E），且以上结果通过免疫荧光得以证实（图6F-H）。综上，这些发现支持暴露于铜离子载体后脂酰化蛋白功能的毒性增加至少部分由其异常寡聚化介导。这些发现与在细菌和酵母中观察到的铜可以破坏含Fe-S蛋白质的稳定性是一致的。

图6 铜直接结合并促进脂酰化DLAT的低聚。

铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同

质谱分析显示，铜离子载体处理以FDX1依赖性方式（图7C）导致Fe-S簇蛋白（图7A、B）的损失以及蛋白毒性应激的诱导（图7）。为了探讨与铜离子载体治疗相关的铜毒性机制是否与这些自然发生的铜稳态失调共有，团队分别研究了以下三个实验模型：

（1）在HEK-293T和ABC1细胞中过表达SLC31A1，这大大提高了细胞对铜生理浓度的敏感性（图7E）；与在野生型细胞中使用铜离子载体的发现一致，铜补充可导致参与线粒体呼吸的蛋白质总体、蛋白质脂酰化、Fe-S簇蛋白质水平的降低，以及HSP70水平的升高（图7F）；

（2）铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能阻止过表达SLC31A1的细胞中铜诱导的细胞死亡（图7G），而铜螯合剂FDX1 KO和LIAS KO可各自部分拯救铜诱导的细胞死亡（图7G、H）；此外，天然细胞内铜伴侣谷胱甘肽的消耗导致铜依赖性细胞死亡（图7I），这与被FDX1和LIAS减弱的脂酰化减少和DLAT寡聚化增加相关，正如用铜离子载体处理SCL31A1野生型细胞所观察到的一样（图7J）。

（3）将老年Atp7b缺陷（Atp7b^−/−）小鼠肝脏与Atp7b杂合子（Atp7b^–/+）和野生型对照小鼠肝脏比较，发现脂酰化和Fe-S簇蛋白的丢失以及Hsp70丰度增加（图7K）。

这些在铜毒性小鼠模型中的发现表明，铜过载导致的细胞效应与铜离子载体诱导的细胞效应相同。

图7 铜直接结合并促进脂酰化DLAT的低聚。

总之，团队的所有数据支持过量铜可促进脂酰化蛋白的聚集以及Fe-S簇蛋白的不稳定，导致蛋白毒性应激并最终导致细胞死亡（图7L）。至此，团队建议将这种先前从未表征的细胞死亡机制称为铜死亡（cuproptosis）。

参考文献

Kahlson MA, Dixon SJ. Copper-induced cell death. Science. 2022;375(6586):1231-1232.

Rowland EA, Snowden CK, Cristea IM. Protein lipoylation: an evolutionarily conserved metabolic regulator of health and disease. Curr Opin Chem Biol. 2018;42:76-85.

Solmonson A, DeBerardinis RJ. Lipoic acid metabolism and mitochondrial redox regulation. J Biol Chem. 2018;293(20):7522-7530.

Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375(6586):1254-1261.