众所周知，基础研究中难的不是实验，而是如何找到有研究价值的主角分子，并将主角分子的故事讲好。要想讲好主角分子的故事，就需要我们先将故事线理好，这样才能让科学研究做到事半功倍。
今天要给大家分享的是今年4月份发表在Molecular Cancer上的一篇文章：“Circular RNA MTCL1 promotes advanced laryngeal squamous cell carcinoma progression by inhibiting C1QBP ubiquitin degradation and mediating beta-catenin activation”，文章主要是讲喉鳞癌（LSCC）中的circMTCL1结合RBP蛋白C1QBP，抑制其泛素化降解，随后两者共同调控Wnt/β-catenin信号通路活性，参与调节LSCC疾病进展。接下来，小编将带领大家将文章掰开揉碎来看下作者是如何找到主角分子，并将主角分子的故事线理顺的。
CircMTCL1故事线：
“工欲善其事，必先利其器”，对于科学研究，这个“器”小编认为非主角分子莫属了。那么这篇文章的作者是如何确定主角分子的呢，主要分为两部分：
1.生信分析初步筛选目标circRNA
作者首先通过二代测序技术筛选LSCC患者肿瘤组织中差异表达的circRNA；随后对top20中read count数大于2的circRNA进行表达验证；最后通过RNase R酶消化实验锁定目标circRNA—circMTCL1。
2.临床样本及细胞表型实验明确目标circRNA
生信分析筛选出circMTCL1后，需进一步明确其是否真的适合用于后续研究。在确定circMTCL1的circRNA特性之后，作者在临床样本中检测其表达量，并分析其与LSCC患者临床病理特征及预后的相关性；最后分析其对LSCC细胞表型的影响，主要通过敲减或过表达circMTCL1后，分析LSCC细胞增殖、迁移和侵袭变化。
在确定主角分子之后，就可以展开故事了，即研究LSCC中该主角分子的具体作用机制。故事的展开是由点到面的过程，第一笔如何画直接关系到最后这个面的呈现情况。
第一步：确定circMTCL1互作的RBP蛋白C1QBP
对于circMTCL1的作用机制，作者直接从RBP角度出发，利用RNA pull-down结合蛋白质谱分析，确定与circMTCL1结合的蛋白C1QBP。随后在临床样本中检测C1QBP的表达量，并分析其与LSCC患者预后的相关性。
第二步：确定circMTCL1与C1QBP的结合关系
上一步确定circMTCL1与C1QBP之间存在结合关系，但是直接还是间接结合有待确定。通过FISH实验确定细胞中两者的共定位后，作者对两者的结合位点进行突变处理，结合RNA pull-down以及RIP明确两者之间是直接结合，最后利用ISH和IHC在临床样本中进行进一步验证。
第三步：确定circMTCL1抑制C1QBP的泛素化降解
确定circMTCL1与C1QBP的结合关系之后就需要确定circMTCL1与C1QBP之间的作用关系了。作者分别敲减或过表达circMTCL1和C1QBP，发现circMTCL1参与调控C1QBP蛋白水平；随后，利用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132分别处理circMTCL1敲减或过表达的LSCC细胞，明确circMTCL1抑制C1QBP的蛋白降解；最后通过分析敲减circMTCL1后C1QBP的泛素化水平，明确circMTCL1抑制C1QBP的泛素化降解。
第四步：确定circMTCL1-C1QBP调控 Wnt/β‑catenin信号通路活性
那么接下来就需要确定circMTCL1-C1QBP以何种方式参与调控LSCC细胞表型。作者对C1QBP进行了功能富集分析，发现其显著富集到Wnt信号通路上。随后作者发现敲减或过表达circMTCL1后，β-catenin的表达水平及磷酸化水平均发生明显变化，同时功能挽救实验（在circMTCL1过表达的LSCC细胞中敲减C1QBP）提示circMTCL1通过C1QBP影响Wnt/β-catenin信号通路活性进而影响LSCC细胞表型。
最后，作者通过敲减或过表达C1QBP分析β-catenin表达变化，并利用co-IP实验确定C1QBP与β-catenin之间的结合关系。
第五步：动物模型验证circMTCL1的作用机制
前面四步已经将整个故事串联好，最后一步就是在动物模型上进行验证分析。作者构建了circMTCL1敲减的LSCC小鼠模型，通过分析肿瘤生长变化、肿瘤转移情况以及肿瘤组织中circMTCL1、C1QBP、β-catenin表达变化，明确circMTCL1促进LSCC的生长和转移。
至此，作者就将这篇27+分的Molecular Cancer文章中主角分子circMTCL1的故事讲清楚了。circMTCL1故事线的展开其实就是作者展开实验的顺序，当然，实际操作过程中遇到弯弯绕绕是避免不了的，但其中的艰辛就不足为外人道了。希望通过这篇文章的解读能够对大家寻找疾病相关主角分子并展开主角分子的故事线有所启发。
文章机制图
文章来源：小张聊科研